RhoA/Rho激酶信号途径在门静脉高压发病机制中的研究进展

杜庆红(综述)，韩 琳，李卫红(审校)

(北京中医药大学基础医学院病理教研室，北京 100029)

门静脉高压(portal hypertension，PHT)是肝硬化形成过程中和形成后的一个重要病理过程，并且引起很多严重的并发症，严重影响了患者的生存质量。PHT的发病机制有前向血流和后向血流两种学说。后向血流理论认为，肝内血管阻力升高是PHT形成的始动因素，这是PHT形成的最经典理论。前向血流理论的核心是，PHT后期内脏高动力循环形成，内脏血管舒张物质增多，对血管收缩物质反应性下降，导致血管扩张、门静脉血流量增多，从而维持门静脉高压状态[1-2]。研究表明，肝内和肝外RhoA/Rho激酶信号途径调节失常参与PHT的形成。

1 RhoA/Rho激酶信号途径概述

RhoA蛋白属于Ras蛋白超家族成员。在细胞代谢过程中，RhoA蛋白与鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)结合为活性状态，与鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)结合为非活性状态。通过GTP与GDP之间的转换,从而触发或终止细胞级联活化反应。通过磷酸化过程，RhoA-GDP转换为RhoA-GTP；通过去磷酸化过程，RhoA-GTP转换为RhoA-GDP，从而起到分子开关的作用。鸟苷酸交换蛋白或鸟苷酸交换因子控制Rho蛋白GDP与GTP的交换。从GDP结合形式到GTP结合形式为正调控，从GTP结合形式到GDP结合形式为负调控[3-4]。研究发现，参与正向调控的交换蛋白为GDP解离促进蛋白，参与负向调控的交换蛋白为GDP解离抑制蛋白，通过正向调控和负向调控调节Rho蛋白的活性[5]。另外，GTP酶激活蛋白也参与调节Rho蛋白活性，使Rho蛋白从活性状态变为无活性状态。

1996年，Rho kinaseα/ROCK2和Rho kinaseβ/ROCK1被发现是Rho蛋白最主要的下游效应蛋白。其中，ROCK1主要表达于炎性细胞，ROCK2表达于血管平滑肌细胞，参与血管平滑肌细胞的迁移、增殖等[6]。研究证明，与PHT发病相关的主要是ROCK2[7]。ROCK2的分子结构包括N端的催化结构域、中央Rho结合的卷曲螺旋结构域和C端调节性结合结构域。激动剂与细胞膜上的G蛋白偶联受体结合，引发Rho蛋白GDP结合形式与GTP结合形式之间的转换。Rho激酶接受RhoA传递的活化信号，继而导致多个氨基酸位点的磷酸化，并介导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应。

肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase，MP)、肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)、ezrin/radxin/moesin家族、内收蛋白、phosphatase and tensin homolog on chromosome 10、单丝氨酸蛋白激酶及蛋白激酶C抑制蛋白(protein kinase C-potentiated inhibitor protein，CPI-17)均属于Rho激酶的底物。MP由3个亚单位组成，包括(110～130)×103肌球蛋白靶标亚单位(myosin targeting subunit，MYPT1)、20×103功能不明的小亚单位和37×103催化亚单位。活化的Rho激酶磷酸化MYPT1肽链的696位苏氨酸，从而使MP失活。失活的MP失去将MLC脱磷酸化的作用，导致细胞质内磷酸化的MLC水平提高，肌动肌球蛋白交联增加，从而促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，血管收缩[8]。CPI-17与肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)结合后，掩盖MLC催化亚单位，从而抑制MLCP的活性，促进平滑肌细胞收缩。目前，参与PHT形成的研究最多的Rho激酶底物是MP、MLC及CPI-17。

2 RhoA/Rho激酶信号途径与钙敏化

在平滑肌的收缩过程中，MLC的磷酸化水平是决定平滑肌收缩程度的一个重要因素。在正常的条件下，血管收缩物质通过提高细胞内Ca2+水平及其敏感性促进血管收缩。前者依赖Ca2+/钙调蛋白，后者不依赖Ca2+，而是通过抑制MLCP的活性提高MLC的磷酸化水平，促进平滑肌收缩。即使Ca2+浓度不变，Ca2+敏感性的变化也会引起MLC磷酸化水平和平滑肌收缩的改变。研究发现，激活的Rho激酶磷酸化CPI-17，磷酸化的CPI-17与MLCP结合后，掩盖肌MLC催化亚单位，从而抑制MLCP的活性，促进平滑肌细胞的收缩，此即钙敏化过程[9]。

3 RhoA/Rho激酶信号途径与PHT

3.1RhoA/Rho激酶信号途径在后向血流机制中的作用 PHT时肝内血管阻力升高包括两方面的因素，其中机械性因素占70%，功能性、可改变的因素占30%[10]。机械性因素主要表现为各种因素导致的肝组织纤维增生，肝内的血管结构重建，门静脉血液回流阻力增加；功能性因素一方面表现为肝内收缩细胞数目增多，主要是活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，另一方面体现在肝窦内皮细胞损伤，血管活性物质的不平衡，血管舒张物质减少，收缩物质增多，血管张力增加[11]。肝窦内皮细胞损伤和HSC活化是PHT的关键环节。HSC位于肝窦内皮细胞的周围，属于另外一种肝非实质细胞。各种原因导致的肝细胞损伤，肝窦周围的HSC经历形态学和功能学上的变化，成为肌纤维母细胞样的细胞。活化后的HSC具有增强的纤维生成能力，能够收缩，有免疫调节和迁移潜能[12]。HSC活化以后表达平滑肌样蛋白，通过收缩使肝窦管径变小，肝内血管阻力增加，门脉压力升高；分泌细胞外基质蛋白，导致Disse间隙毛细血管化，肝细胞与血液不能充分进行物质交换，加重肝细胞损伤。研究发现，肝硬化时肝组织中RhoA/Rho激酶信号途径与HSC的活化有非常重要的关系[13-14]。

早在1999年，Kawada等[15]发现，Rho激酶的抑制剂Y-27632可抑制离体培养的HSC的MLC磷酸化水平，从而减弱HSC的迁移和收缩，降低HSC的能动性。Zhou等[16]发现，在胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)导致的PHT模型中肝脏RhoA和Rho激酶在基因和蛋白水平表达增加，肝硬化大鼠和肝硬化患者肝脏Rho激酶活性升高。静脉注射Y-27632可降低离体灌流肝脏对血管收缩物质的敏感性，降低门静脉压力，并且降压效果与剂量相关[17]。然而,大剂量Y-27632在降低门静脉压力的同时，其在内脏循环的血管扩张作用也带来了内脏循环阻力降低和平均动脉压力降低的不良反应。因此，开发专门针对肝脏Rho激酶的靶向抑制剂成为解决此问题的关键。Klein等[18]将Y-27632与载体结合，通过靶向抑制活化的HSC，抑制Rho激酶的活性，降低肝内血管阻力，同时对体循环无不良反应。Xu等[19]发现，丹参的有效成分丹酚酸B也可抑制RhoA和Rho激酶的活化，减弱内皮素1诱导的HSC收缩，降低门静脉压力。Hennenberg等[20]发现，多激酶抑制剂sorafenib也可以抑制肝组织Rho激酶在蛋白和信使RNA水平的表达，降低Rho激酶的活性，从而降低肝内血管阻力、降低门静脉压力，然而，sorafenib对于肝外血管阻力没有影响。因此推测，在肝外血管还有其他机制调控Rho激酶的表达，这也是待解决的问题之一。

3.2RhoA/Rho激酶信号途径在前向血流机制中的作用 在肝外方面，BDL大鼠胸主动脉RhoA蛋白表达没有变化。但在胸主动脉和肠系膜动脉，Rho激酶表达和活性下降，并且这种降低与主动脉的收缩性下降有关[21]。Y-27632可显著提高离体主动脉环的收缩性[22]。Y-27632对假手术大鼠肝内循环阻力几乎没有影响，但是能够降低内脏循环的血流阻力，并且这种效应比在BDL大鼠更显著。由此说明，在生理状态下，RhoA/Rho激酶信号途径主要在于调节内脏血管收缩、维持血液循环阻力。BDL大鼠内脏组织Rho激酶表达下降是内脏血管扩张的原因之一。RhoA/Rho激酶信号途径升高肝脏血管阻力的效应强于在内脏降低血管阻力的效应，所以Y-27632能够降低门静脉压力。Hennenberg等[23]在另外的研究中发现，BDL大鼠胸主动脉Rho激酶的底物MYPT1和CPI-17表达下降，使得胸主动脉钙敏化减弱，促进动脉扩张。根据目前PHT高动力循环的研究进展，PHT时不只是胸主动脉和肠系膜动脉扩张，血液汇入门静脉的脏器血管均处于过度扩张状态。RhoA/Rho激酶信号途径在内脏组织血管中的变化还不得而知。

4 小 结

RhoA/Rho激酶信号途径在纤维化肝组织和离体活化的HSC表达增加，促进HSC收缩，导致肝内门静脉回流阻力增加。而在肝外组织，Rho激酶活性下降，促进内脏血管扩张，导致PHT不断恶化。并且，在PHT动物模型，靶向抑制肝组织Rho激酶的活性可显著降低门静脉压力。由此可见，RhoA/Rho激酶信号途径在调节肝内和肝外血管阻力、升高门静脉压力方面发挥了重要作用。以该途径为切入点，开发治疗PHT的药物将为解决目前PHT治疗窘境提供一个新思路。

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