色谱技术在检测牛奶中激素类药物残留的应用

刘长姣，郭镧，袁述，孟宪梅，余平

(1. 吉林工商学院 粮油食品深加工吉林省高校重点实验室 吉林 长春 130062；2. 吉林工商学院 食品工程分院，吉林 长春 130062)

牛奶及其制品营养丰富，已经成为人们日常生活中的主要食物之一。在奶牛饲养过程中，为促进奶牛生长、提高牛奶产量，人们会违规使用激素类药物，进而导致牛奶中激素残留问题日益严重。根据实验室研究和流行病学调查结果，激素类药物残留可通过食物链(动物体内残留)和环境(饮用水及排泄物)对人体健康和动物健康、社会和生态环境造成直接和潜在的危害[1-4]。2004目前世界上许多国家和地区已经禁用了相关激素类物质或对其做出了严格规定。例如欧盟、日本和中国对牛奶中皮质激素中的倍他米松的最大残留限量为 0.3µg/kg，食品法典委员会（CAC）规定最大残留限量为0.05µg/kg，对雌激素中的己烯雌酚中国和日本均要求不得检出。在检测牛奶中兽用激素类药物残留的过程中，因为激素类药物结构相似、理化性质与许多内源性成分相近，其残留浓度可能接近或稍高于生理水平，所以对结果评判的准确性要求较高，并且需要有效的样品前处理和高灵敏度的分析设备来保证理想的分析灵敏度、选择性、专属性和准确性。由此可见利用有效的检测技术来准确的测定和监控牛奶中激素类药物的残留是检测领域的热点和难点[5]。

检测技术的进步是解决此问题的关键。随着色谱技术和色谱质谱联用技术的进步，液相色谱、气相色谱及其与质谱联用技术在牛奶中激素残留检测过程中发挥了重要作用。本文综述了色谱和色谱质谱联用技术在检测牛奶中五类激素的研究进展。

1 牛奶中激素类药物残留的原因及危害

牛奶中残留的激素来源主要来自两方面，一是奶牛自然生长过程中产生的激素，二是人为添加激素。在奶牛喂养过程中，人为添加激素有助于提高牛奶的产量、饲料转化率和药理作用人工化，如人为的抑制动物发情、增强食欲等，从而提高经济效益。无论是在允许或禁止使用激素类物质作为促生长剂的国家和地区，经济利益的驱动通常会导致激素类药物的滥用[5]。研究结果显示，牛奶中残留的性激素对人体的生殖系统和生殖功能造成严重影响，食用残留性激素的牛奶或其制品，显著增加患前列腺癌或更年期乳腺癌的几率[5-6]。青春期前儿童体内产生雌激素少，暴露于外源性激素，可能使其生长加速或出现乳房发育。

2 色谱及其与质谱联用在激素残留检测中的优势

现代色谱技术主要包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、各种薄层色谱(TLC)以及超临界流体色谱(SFC)等各种色谱和色谱联用技术。在牛奶及奶制品毒害物质残留检测方面，气相色谱与液相色谱及它们与质谱(MS)联用技术应用最多[7-8]，各检测技术的优缺点见表1。高效液相色谱法和气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高等特点，但包括它们在内的色谱技术的主要缺点是定性能力较差。而质谱的多种扫描方式和质量分析技术，可以有选择的只检测所需要的目标化合物的特征离子，而不检测不需要的质量离子，如此专一的选择性，不仅能排除基质和杂质峰的干扰，还极大地提高了检测灵敏度。色谱与质谱联用法是将高分离能力的色谱技术与高灵敏、高专属性的质谱技术联接起来，成为一种多用途、高灵敏的定性、定量分析方法。色谱与质谱联用的优势体现在可获得质量、保留时间、强度三维信息，所以已越来越多地被应用于牛奶及奶制品激素类药物残留的检测。在方法的选择上使用最多的是液相色谱-质谱/质谱、气相色谱-质谱/质谱、气相色谱-高分辨质谱等[9-14]。

表1 不同色谱检测技术的优缺点Table 1 The advantages and disadvantages of different chromatography detection methods

GC/MS 分离效能高、选择性强、灵敏度高、定性和定量能力强样品需要气化，应用范围有限制、样品前处理要求高、设备昂贵。[12]

3 牛奶中激素残留色谱检测方法的研究现状

目前有残留限量的激素类药物种类，按照其种类可分为皮质激素、孕激素、雄激素、雌激素和β－受体激动剂。而牛奶中五类激素残留浓度极低，所以牛奶中激素类药物残留的检测属复杂基质中痕量组分的分析。牛奶中激素类药物残留的检测方法主要分为免疫分析法和色谱质谱分析法。免疫分析法是单一测定方法仅能测定几种特定的激素类药物[15]，色谱法可以进行多组分分析。所以近年来，色谱法已被广泛应用，逐步取代了单一的测定方法[16]。近几年国内外学者应用液相色谱、液质联用、气相色谱和气质联用技术对牛奶中这五类激素类药物的检测进行了深入研究，检测技术不断得到发展和进步。

3.1 皮质激素

皮质激素临床主要用于升高血糖降低血酮以刺激奶牛的食欲，诱导分娩和抗炎；常用药物有倍他米松、地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙等。崔晓亮等采用超高效液相色谱——串联电喷雾四极杆质谱在多反应监测模式下测定了牛奶中12种糖皮质激素的残留。样品经提取、浓缩和净化处理得测试样品，以Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18为色谱柱，以甲醇和含 0.1%甲酸的水为流动相进行梯度洗脱。方法的检出限为0.02～0.38µg/kg，最低定量限为0.07～1.27µg/kg；添加水平为2µg/kg和0.4µg/kg时，12种糖皮质激素的加标回收率为69.3%～94.3%，相对标准偏差为3.5%～16.7%[17]。马育松等采用液相色谱—质谱/质谱法测定牛奶和奶粉中地塞米松残留量。样品用乙腈提取，C18 固相萃取柱净化，得测试样品，采用基质匹配外标曲线法定量。在 2.0～400ng/mL 浓度范围内呈良好线性，方法的测定低限：牛奶为 0.2µg/kg，奶粉为 1.0µg/kg。牛奶样品在添加浓度为0.2～10µg/kg的范围内，回收率为 70.0%～110.0%；奶粉样品在添加浓度为1.0-10µg/kg的范围内，回收率为 65.0%～100.0%，相对标准偏差在 8.65%～12.8%之间[18]。

3.2 孕激素

孕激素临床主要用于先兆流产和习惯性流产、功能性子宫出血、子宫内膜异位症、避孕等[19]。常用药物包括黄体酮、甲羟孕酮、甲地孕酮等。陈晓红等建立牛奶中21а-羟基孕酮、17а-羟基孕酮、炔孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和孕酮8种孕激素残留的超快速液相色谱-串联质谱检测方法。样品经提取、净化，在 Shim-pack XR-ODSⅡ快速柱上，以内含0.1% (V/V)甲酸和5mmol/L乙酸铵的乙腈/水溶液进行梯度洗脱分离，采用正离子模式多反应监测模式测定。各待测物在0.5～50.0µg/kg范围内具有良好的线性，回收率为 73.0% - 97.5%，相对标准偏差在 3.8%～8.6%之间，最低定量检出限为0.1µg/kg～ 0.5µg/kg。方法简便、快速、干扰少、特异性强，适合于牛奶中痕量孕激素残留的检测[20]。

3.3 雄激素

雄激素临床主要用于睾丸功能不全、功能性子宫出血、子宫肌瘤、卵巢癌、再生障碍性贫血及老畜骨质疏松症等[19]。常用药物包括睾酮、甲基睾酮、和同化雄激素苯丙酸诺龙等。吕惠卿等采用固相萃取——液相色谱串联质谱仪，建立了牛奶中睾酮、孕酮、诺龙、甲基睾酮、勃地龙、群勃龙、美雄酮、康力龙 8 种同化激素残留量的快速测定方法。样品采用叔丁基甲醚提取，通过 C18固相萃取柱净化，氮吹至干，残留物用甲醇—水(10:90，V/V)溶解后测定。采用 MRM 模式进行定性定量分析。该方法的检出限为 0.2～0.5µg/L，定量限为 0.5～1.0µg/L；在 2.0～200.0µg/L 范围内线性关系良好；在 1.0 ～5.0μ g/L 的添加水平上，8 种激素的平均回收率在 59.1%～97.7% 之间，相对标准偏差为 3.2%～11.9%[21]。

3.4 雌激素

雌激素临床主要用于卵巢功能不全和促进发情、功能性子宫出血、退乳及乳房肿痛及老畜的骨质疏松症的治疗等[22]。常用药物包括β－雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、己烷雌酚等。薛敏等以β-雌二醇和炔雌醇的分子印迹聚合物为填料制备固相萃取小柱，对牛奶中雌激素进行富集，应用高效液相色谱法，建立了基于分子印迹固相萃取技术检测牛奶中雌激素的新方法，检出限低于 0.1mg/L，回收率高于 80%[23]。周建科等建立了牛奶中5种雌性激素( 雌三醇、雌二醇、炔诺酮、雌酮、己烯雌酚) 同时测定的高效液相色谱法。样品经脱蛋白和浓缩后得测定样品，采用反相高效液相色谱法，以乙腈- 水(1︰1，V/V) 为流动相，5种雌性激素分离效果良好，平均回收率范围为67.0 %～95.5 %，方法检出限为1.0-2.0μ g/L[24]。刘敏等建立了中空纤维液相微萃取-高效液相色谱联用(HP-LPME-HPLC)检测牛奶中的雌二醇的含量。采用自制的中空纤维萃取装置，用100µL正辛醇作为萃取溶剂，在600r/min搅拌速度下萃取1h，雌二醇的富集倍数可达200倍，最低检出限0. 571 ng/ml[25]。刘勇军等通过液液萃取和固相萃取提取、净化牛奶中添加的雌三醇，衍生化后，经气相色谱- 质谱联用对衍生物检测分析，检出限为0.5µg/L， 衍生物的峰面积与样品质量浓度在1～1000µg/L范围内呈良好的线性关系，不同雌三醇的加标回收率在78.2%～86.7%之间[26]。

3.5 β－受体激动剂

β－受体激动剂是一组选择性β 2－肾上腺素受体激动剂，常用药物有克伦特罗，沙丁胺醇及其盐、酯，西马特罗及其盐、酯及制剂。该类药物内服或注射均易被吸收，排泄速度快，用药量5～15倍时会导致动物可食性组织蓄积大量药物残留，食用后会引起人体心血管和中枢神经系统的毒副作用。朱勇等建立了同时测定牛奶中克伦特罗、氯霉素和己烯雌酚残留量的同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱分析方法。牛奶样品无需蛋白沉淀，直接经HLB 小柱净化及水和正己烷淋洗，由乙酸乙酯洗脱后进行分析。采用 Acquity UPLC BEH C18色谱柱进行分离，以乙酸铵溶液－乙腈作为流动相进行梯度洗脱，MRM 方式测定，同位素稀释内标法定量。克伦特罗、氯霉素和己烯雌酚在牛奶样品中的检出限分别为 0.009、0.007和 0.04ng/g。牛奶中 3 种药物在 0. 05～0.10(克伦特罗)、0.30～0.60(氯霉素)、0.50～1.0ng/g(己烯雌酚)加标水平下的回收率为 94%～107%，相对标准偏差均小于 10%[27]。岳秀英等应用GC一MS测定牛奶中盐酸克伦特罗。样品经提取、净化和衍生化后，牛奶中其3个添加浓度水平(0.005、0.01和0.02μ g/mL)的回收率为70%～170%，相对标准偏差为20%(n=5)，最低检出限为5ng/mL，满足残留分析的要求[28]。

4 展望

牛奶及其制品中激素残留是涉及人类健康的公共卫生问题，准确、快速的检测方法是控制和解决牛奶中激素残留问题的根本途径。色谱技术因具有分辨率高、灵敏度高、分析速度快、重复性好、检测限低、选择性强、定性和定量能力强等优点而广泛的应用于牛奶中激素类药物残留的检测。同时检测技术从单一激素残留检测发展到多种激素残留的同时速测定。除了检测技术的进一步发展，检测样品的前处理技术也得到关注并有一定的进步。因为有效的样品前处理技术直接影响检测结果的准确性。分子印迹、固相萃取及微分子印迹、固相微萃取等技术在样品净化和浓缩处理方面的应用提高了牛奶中激素残留的检测准确度，也进一步促进了色质谱联用法在牛奶中激素及其他危害物质检测中的应用。

对牛奶中激素类药物残留的检测应本着准确、方便、快速的原则，在现有研究成果的基础之上可朝以下几方面发展 ：提高接口术的改进和完善、继续加强与其他先进的前处理萃取技术的联用研究、小型、微型色谱柱的开发、MS谱库识别技术的发展、基质效应的彻底解决，以上都是研究人员值得关注和发展的方向。相信随着色谱技术的日益成熟，其必会在检测牛奶中激素残留方面发挥重要的作用。

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