响应面法优化微波辅助提取蒲公英多糖工艺的研究

郭希娟，马萍，刘远洋

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

蒲公英，别名蒲公草、黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等，为菊科属多年生草本植物。它原产欧洲和北亚，我国南北各地均有分布[1]。它是中医临床常用的中草药，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋、健胃消炎、保肝利胆等功效。蒲公英主要含有多糖、三萜、植物甾醇、绿原酸和黄酮等[2]。目前，研究较多的为蒲公英根部的蒲公英多糖，其具有抗病原微生物、保肝、利胆、抗胃溃疡、免疫功能等作用[3]。试验以蒲公英为研究对象，利用微波萃取技术进行蒲公英多糖的提取，探讨微波提取的最佳提取工艺，以期提高蒲公英多糖的提取效率。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

蒲公英，无水乙醇，氯仿，正丁醇，蒸馏水等。

1.2 主要设备与仪器

循环水式多用真空泵，郑州长城科工有限公司；RE-52A旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限公司；离心机，长沙英泰仪器有限公司；恒温水浴箱，苏州威尔试验用品有限公司；分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；微波炉，美的集团。

1.3 工艺流程

蒲公英→烘干→粉碎→微波提取→真空浓缩→Sevag法脱蛋白→醇沉→蒲公英多糖

操作要点：

（1）蒲公英粉的制作[5]：洗去干蒲公英的尘土和泥沙，60℃烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎，过60目筛备用[4]。

（2）真空浓缩机的使用：旋转蒸发仪的温度控制在50℃，温度过低浓缩时间太长，温度太高易剧烈沸腾，增大误差，每次放在浓缩瓶中的待浓缩液要适量。

（3）Sevag法脱蛋白[6]：向提取液中加入1/4倍体积的氯仿─正丁醇（氯仿：正丁醇=5∶1）溶液，混合20 min，3 500 min·r-1离心5 min，中层白色絮状沉淀为蛋白质，故取上清。

1.4 蒲公英多糖的测定方法

标准曲线的制作[7-8]：取葡萄糖对照品100 mg至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，取该溶液5 mL，至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度。取上述溶液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，至试管中，加适量水使成2 mL，加5%苯酚1 mL，浓硫酸7 mL，50℃水浴15 min，流水冷却，486 nm测吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，多糖浓度（C）为横坐标，得到标准曲线，算出回归方程。A=55.338C+0.059，R2=0.992 0。葡萄糖对照品浓度在0.002～0.014 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

根据此标准曲线测得各样品的含量，计算公式如下：

提取物中多糖含量（%）=（样品中多糖浓度×稀释倍数/称量样品重量）×100%

1.5 蒲公英多糖提取的单因素试验研究

1.5.1 料液比对提取效果的影响

取预处理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到锥形瓶中，以料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）5个水平加入蒸馏水，放入微波炉中，微波功率 300 W，提取15 min，重复试验3次，过滤，合并提取液，减压浓缩至20 mL，然后进行脱蛋白，脱蛋白结束后加入乙醇，使醇浓度达到60%，静止24 h，过滤，干燥称重，并绘制料液比对提取效果的影响曲线图。

1.5.2 微波提取时间对提取效果的影响

取预处理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到锥形瓶中，以料液比为1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，放入微波炉中，微波功率300 W，提取时间分别为5、10、15、20、25 min等5个水平，重复试验3次，过滤，合并提取液，减压浓缩至20 mL，然后进行脱蛋白，脱蛋白结束后加入乙醇使醇浓度达到60%，静止24 h，过滤，干燥称重计算提取率，并绘制微波提取时间对提取效果的影响曲线图。

1.5.3 微波提取次数比对提取效果的影响

取预处理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到锥形瓶中，以料液比为1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，然后放入微波炉中，微波功率300 W，提取15 min，分别重复试验1、2、3、4、5次，过滤，合并提取液，减压浓缩至20 mL，然后进行脱蛋白，脱蛋白结束后加入乙醇使醇浓度达到60%，静止24 h，过滤，干燥称重计算提取率，并绘制微波提取次数对提取效果的影响曲线图。

1.5.4 醇沉浓度对提取效果的影响

取预处理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到锥形瓶中，以料液比为1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，然后放入微波炉中，微波功率300 W，提取时间15 min，重复试验3次，过滤，合并提取液，减压浓缩至20 mL，然后进行脱蛋白，脱蛋白结束后加入乙醇，乙醇浓度分别为55%、60%、65%、70%、75%5个水平，静止24 h，过滤，干燥称重计算提取率，并绘制乙醇浓度对提取效果的影响曲线图。

1.6 微波提取蒲公英多糖的响应面优化

在单因素试验的基础上，采用二次回归通用旋转设计试验方案，以料液比、提取时间、醇沉浓度为试验因素，分别以X1、X2、X3表示，以多糖回收率y为评价指标，优化微波辅助蒲公英多糖提取的最佳工艺，其因素水平编码见表1。

表1 试验因素水平及编码表Table 1 Factors and code levels

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对多糖提取率的影响

图1 料液比对多糖提取效率的影响Fig.1 Effect of ratio between water and dandelion on the polysaccharide

由图1可以看出，在一定相同条件下，提取蒲公英多糖质量开始时随着料液比的增大而增加，在料液比为1∶15（g∶mL）时最高，之后随着料液比的增加而出现下降的趋势。这是因为料液比未达到1∶15（g∶mL）时，蒲公英多糖不能完全溶于水中，多糖的浓度随着料液比的增加逐渐降低。

2.1.2 微波提取时间对多糖提取率的影响

图2 微波时间对多糖提取效率的影响Fig.2 Effect of ultrasound treatment time on the polysaccharide

由图2可以看出，多糖提取质量随微波时间的变化规律，呈现先上升而后逐渐下降的趋势，微波作用时间为15 min时达到最大值，提取时间过短，多糖溶解不充分，但时间过长又容易引起多糖结构的变化进而使提取率降低。

2.1.3 微波提取次数对多糖提取率的影响

蒲公英提取多糖质量在提取3次时达到最大值，之后略有下降，但幅度不明显。刚开始上升可能是因为随着提取次数的增加多糖的溶解逐渐增加，在提取3次时多糖基本溶解，以后随着提取次数的增加，多糖的提取率不变，同时次数太多也会对多糖的结构有轻微改变，因此在多因素试验中提取次数确定为3次。

图3 微波提取次数对多糖提取效率的影响Fig.3 Effect of ultrasound treatment times on the polysaccharide

2.1.4 醇沉浓度对多糖提取率的影响

图4 乙醇浓度对多糖提取效率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the polysaccharide

由图4可以看出，当醇沉浓度为60%时多糖提取率达到最大值，以后随着醇沉浓度的升高多糖提取质量逐渐减少。可能是高浓度的乙醇使得多糖的结构发生改变造成多糖回收率的下降。

2.2 微波提取的响应面试验

2.2.1 模型的建立及显著性检验

试验安排与结果见表2，对表2的数据，应用Design Expert 8.0软件进行多元回归分析，得到蒲公英多糖得率与微波处理各因素编码值的二次方程模型：

其中模型的决定系数R2=0.922 6，校正的R2= 0.853 0。

表2 试验设计方案与试验结果Table 2 Experiment design matrix and results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

从表3可以看出所建立的回归方程是极显著的（P＜0.01），失拟检验是不显著的（P=0.057 5），X1，X3因素的一次项均达到显著水平（P＜0.05），交互项X1X3，X2X3均达到显著水平（P＜0.05），各因素的二次项均达到极显著水平（P＜0.01）。这表明该模型拟合程度良好，试验误差小，所建立的模型是合适的，可以用此模型对红小豆煮制工艺条件进行分析测定。从F值可以看出因素的主次顺序为：醇沉浓度＞料液比＞提取时间。

2.2.2 响应面分析

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。根据回归方程，作出响应面和等高线，考察拟合响应曲面的形状，从中分析料液比、提取时间和醇沉浓度对蒲公英多糖提取率的影响，结果如图5、图6所示。

由图5、图6可以看出，料液比和醇沉浓度、醇沉浓度和提取时间的响应曲面均为开口向下的凸形曲面，随着因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小。由图5可以看出当提取时间为15 min时，蒲公英多糖提取率随着醇沉浓度和料液比的加大而急剧增加，表现为等高线更为陡峭，且醇沉浓度对多糖提取率的影响大比料液比略强。当醇沉浓度大于63%，液料比大于12.5∶1时，多糖提取率增加变缓，等高线形状逐渐向椭圆型发展，这说明醇沉浓度和料液比之间有较强的交互作用。从图6可以看到，等高线呈现明显的椭圆形，这表明在固定料液比为1∶15时，多糖提取率随着醇沉浓度和提取时间的加大而急剧增加，但当多糖提取率达到最高值后仍有下降趋势，这充分表明了醇沉浓度和提取时间两个因素有一定的交互作用。通过响应曲面的交互效应分析，可发现各因素之间的交互作用对蒲公英多糖提取率有重要影响。

图5 微波醇沉浓度和料液比交互影响的三维曲面图和等高线图Fig.5 Surface and contour plots of the mutual-influence of ethanol concentration and material liquid ratio

图6 微波醇沉浓度和时间交互影响的三维曲面图和等高线图Fig.6 Surface and contour plots of the mutual-influence of ethanol concentration and time

2.2.3 提取工艺条件的验证

为进一步确定最佳点，在模型浓度范围内选择出发点，使用快速上升法进行优化，得到的微波提取蒲公英多糖最佳方案为：料液比1∶17、微波时间14 min，醇沉浓度64%，提取率75.47%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，以上述条件进行试验结果的验证，重复3次，实际测得的平均提取率为74.34%，与理论预测值相比，其相对误差约为1.49%。

3 结论

采用微波技术对蒲公英中多糖进行提取，在单因素试验基础上利用中心组合试验设计对微波提取工艺进行优化，得出微波提取蒲公英多糖的较优工艺条件为：料液比1∶17、超声时间14 min，醇沉浓度64%，提取率74.34%。所得多糖提取率与微波处理各因素变量的二次方程模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定应用价值。

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