EMT与非EMT细胞在大肠癌侵袭转移中的作用

王雅娟，胡 洁，赵海燕，韩慧霞

(南方医科大学病理学系，广东广州510515)

上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)与非EMT 细胞是共同完成自发转移的过程，由EMT 细胞负责降解细胞周围的基质，为非EMT 细胞铺平了侵袭转移的道路［1］。此观点与以往认为的发生EMT 的肿瘤细胞，其侵袭性比非EMT细胞强有不同之处。那么在大肠癌中发生EMT 的细胞与非EMT 细胞之间是否也存在这样的协同合作关系呢?本实验使用转化生长因子-β1(TGF-β1)长期诱导大肠癌HT29 细胞使之发生EMT，将EMT与非EMT 的细胞混合培养，探讨两者在转移过程中是否存在协同关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TGF-β1(Peprotec 公司);RPMI1640 培养基(莱德尔生物公司);新生牛血清(吉泰公司);Trizol 试剂(南京凯基公司);反转录(Reverse Transcription System)试剂盒和荧光定量(SYBR Premix ExTaqTM)试剂盒(TaKaRa 公司);E-钙黏素(Ecadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH 引物(上海英骏公司合成)。绿色荧光蛋白质粒(GFP)和红色荧光蛋白质粒(RFP)(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人大肠癌细胞系HT29 为本室冷冻保存;采用含20%新生牛血清的RPMI1640 培养基，至37 ℃、5% CO2培养箱内培养。用10－5g/L浓度的TGF-β1 连续刺激HT29 细胞［2-3］。

1.2.2 RT-PCR 检测:10－5g/L TGF-β1 连续刺激10 d后HT29 中Ecadherin 和Vimentin 的表达

1)RNA 的提取:参照说明书，用Trizol 试剂常规提取细胞总RNA。

2)cDNA 第1 链的合成:按照反转录试剂盒操作程序进行反转录反应。反应总体系为20 μL，其中样品总RNA 2 μL，5 × PrimeScript 4 μL，Prime-ScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，Random 6 mers 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC 水11 μL。37 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 s。

3)Real-time PCR:看家基因GAPDH 为内对照。通过相对荧光定量PCR 方法，同时对Ecadherin、Vimentin和GAPDH 进行检测，计算出不同样本的Ecadherin、Vimentin 的相对表达量(表1)。

表1 Ecadherin、Vimentin和GAPDH 基因引物序列Table 1 Primer sequence of Ecadherin，Vimentin and GAPDH length(bp)

应用Mx7500P 定量PCR 仪进行real-time PCR实验，反应条件为95 ℃5 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 个循环，荧光信号监测。以Folds =2－ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍数比关系，公式如下2－ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］实验组－［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］对照组［4］。重复3 次实验，计算平均值，Ct 值越小，表示起始拷贝数越多。

1.2.3 观察细胞形态:用10－5g/L 浓度的TGF-β1连续刺激HT29 细胞40 d 后，光镜观察细胞形态。首先制作细胞爬片，PBS 洗涤3 次，95%乙醇固定10 min后PBS 洗涤3 次，常规苏木素，伊红染色，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.4 考马斯亮蓝染色观察刺激40 d 后HT29 细胞骨架:培养细胞爬片，PBS 洗涤3 次，每次5 min，95%乙醇固定10 min 后PBS 洗涤3 次，4 min/次，1.5%Triton 振荡洗涤3 次，8 min/次，PBS 洗涤3 次，5 min/次，考马斯亮蓝染液染色40 min，PBS 洗去多余的染液，空气干燥，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.5 细胞的划痕实验:将细胞接种于24 孔培养板中，形成细胞单层，培养20 h 后用10 μL 移液器滴头沿培养板底部呈“一”字型划痕单层培养细胞，显微镜下记录划痕区相对距离，继续培养48 或72 h，倒置显微镜下观察并照相记录。

1.2.6 荧光标记EMT 细胞和非EMT 化细胞迁移实验:RFP 转染刺激前HT29 细胞，GFP 转染刺激后HT29 细胞。转染前1 天将细胞接种至24 孔板中，细胞1 ×105个/孔，培养24 h 后使细胞铺满瓶壁生长。转染前用不含血清的RPMI1640 培养基冲洗细胞两遍后，加入转染试剂，至37 ℃、5%CO2培养箱内培养。4 h 后更换完全培养基。24 h后荧光显微镜观察转染效率。转染20 h 后，直接用自然力分别吹打两种细胞，使细胞脱落，将两种细胞混合培养。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0 统计软件进行处理，实时荧光定量PCR 检测TGF-β1 刺激HT29 细胞前后的Ecadherin、Vimentin 的mRNA 表达水平均采用两样本t 检验的统计学方法。

2 结果

2.1 TGF-β1 连续刺激10 d 后HT29 中Ecadherin和Vimentin mRNA 的表达

2.1.1 总RNA 的提取:电泳检测有3 条清晰的rRNA 带，28S，18S 和5S，说明RNA 无降解(图1)。

2.1.2 统计学分析:HT29 经10－5g/L TGF-β1 连续刺激10 d 后，Ecadherin Ct 值由4.77 ±0.16 变为5.57 ±0.44，表达显著下降(P＜0.05);Vimentin Ct 值由14.96±0.32 变为14.05 ±0.23，表达显著上调(P＜0.05)。

2.2 光镜下观察经TGF-β1 连续刺激40 d 后的HT29 细胞

刺激前的HT29 细胞呈椭圆形，汇合性生长，细胞间的黏附作用强;刺激后的细胞形态较之前变梭，生长较分散，细胞之间的连接不紧密(图2)。

图1 细胞总RNA 琼脂糖凝胶电泳Fig 1 Agrose gel electrophoresis of total RNA from colorectal cancer cell lines

图2 细胞HE 染色Fig 2 Cell morphology(HE×400)

2.3 光镜和考马斯亮蓝染色观察经TGF-β1 连续刺激后的HT29 细胞

刺激后的HT29 细胞蓝色丝网状结构的骨架蛋白明显增多，相邻细胞间骨架连接不如刺激前紧密(图3)。

2.4 划痕实验结果

HT29 细胞成汇合生长，迁移速度不及刺激后的HT29 细胞，两者混合培养后，混合细胞的迁移速度比HT29 快，但比刺激后的HT29 细胞稍慢，在迁移速度较快的细胞中圆形和梭形的细胞均能见到(图4)。

2.5 荧光标记EMT 细胞和非EMT 化细胞迁移实验

自然力吹打细胞混合培养，划痕48 h 后见红、绿色细胞分布均匀(图5)。

图3 细胞考马斯亮蓝染色Fig 3 Observation of cytoskeletal protein by Coomassie blue staining(×400)

图4 划痕实验Fig 4 Scratches test

图5 划痕后48 h 混合培养的细胞Fig 5 Co-culturing two kind of cells，scratches，after 48 hours(×100)

3 讨论

TGF-β1 是一种诱导大肠癌细胞发生EMT 的微环境细胞因子，能引起肿瘤细胞的形态、运动和侵袭能力的改变［5］。HT29 细胞来源于人大肠癌原发灶，在前期实验中，本研究发现HT29 的上皮标志E-cadherin表达很高，间质标志Vimentin 几乎不表达，具有上皮细胞的特征，因此本研究中使用TGF-β1连续刺激HT29 细胞，使之发生EMT。文献报道发生EMT 的细胞丧失上皮表型的同时获得间质表型［6-7］。本实验中经过TGF-β1 刺激后的HT29 细胞Ecadherin表达下降，Vimentin 表达上调。随后的形态学观察，发现刺激后的细胞较未刺激的细胞变梭，生长较分散;并且刺激后的细胞骨架蛋白明显增多，相邻细胞连接不如刺激前紧密，说明细胞间相互作用减少，迁移和运动能力增强。以上实验结果均说明HT29 在使用TGF-β1 连续刺激后，发生了EMT。

EMT 可导致大肠癌细胞侵袭力增强［7-11］。有文献报道当将EMT 化和非EMT 化的肿瘤细胞混合皮下注射到鼠体内成瘤时，两种细胞都能渗入到血管中，非EMT 化的细胞转移到了肺组织。认为EMT 化与非EMT 化的细胞共同完成了转移，EMT 化细胞通过降解细胞周围基质和血管壁，为非EMT 化细胞的侵袭转移铺平道路。此观点与以往所认为的EMT 化的肿瘤细胞，其迁移能力强于非EMT 化的细胞有不同之处［1］。

本研究将EMT 化与非EMT 化的细胞混合培养，发现混合后细胞的迁移速度比非EMT 化细胞快，但比EMT 化细胞慢，在迁移较快的细胞中不单能见到梭形的EMT 化细胞，也能见到偏圆形的非EMT 化细胞。说明EMT 化与非EMT 化的细胞在肿瘤转移中可互相影响。随后将红色和绿色荧光蛋白质粒分别转染非EMT 化和EMT 化的细胞后，混合培养两种转染后的细胞进行划痕实验。由于两种细胞的发光数量较少，无法显示所有细胞的运动状态进而精确定位，但观察到迁移较快的细胞中两种细胞均有，表明当有EMT 化的肿瘤细胞存在时，有利于非EMT 化的肿瘤细胞迁移。推测TGF-β1 刺激HT29 发生EMT 后，其可能通过某种途径改变周围的环境，以利于肿瘤细胞，包括非EMT 化细胞的侵袭转移，又或是因为混合培养后EMT 化与非EMT化的细胞之间有连接，EMT 化细胞“拖动”非EMT化细胞运动。但具体的机制还需要进一步研究探讨。

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