洋葱假单胞菌产脂肪酶条件的优化

王旭愿+张敏+李成涛+沈颖辉+武晶

摘要：采用Rashid N p-nPP比色法，通过单因素试验和正交试验对洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）产脂肪酶的培养基主要成分和发酵条件进行优化，以提高聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的生物降解速率。结果表明，该菌种产脂肪酶的最适培养基为菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化剂Tween-60 2.5 g/L，培养基初始pH 8.0；最适培养条件为接种量9%，培养温度35 ℃，摇床转速130 r/min，培养时间3 d。在此优化培养基条件下，洋葱假单胞菌产脂肪酶活性可达32.935 U/mL。

关键词：洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）；聚丁二酸丁二醇酯（PBS）；脂肪酶；优化

中图分类号：Q939.11+2；TQ925+.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0184-04

Optimization of Production Conditions of the Lipase from Pseudomonas cepacia

WANG Xu-yuan，ZHANG Min，LI Cheng-tao，SHEN Ying-hui，WU Jing

（Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry， Ministry of Education， Shaanxi University of Science & Technology， Xian 710021， China）

Abstract： The colorimetric method of Rashid N p-nPP was used， and single factor and orthogonal experiments were applied to optimize the fermentation medium and culture conditions of Pseudomonas cepacia， in order to improve the production of lipase to improve the biodegradation rate of poly（butylene succinate）（PBS）. The results showed that the optimum medium contained 5.0 g/L rapeseed oil， 0.5 g/L yeast extract， 2.5 g/L emulsifier Tween-60， with the initial pH 8.0. The optimum culture conditions were 9% inoculation， culture temperature 35 ℃， shake rotation 130 r/min and culturing length 3 days. Under the optimum conditions， the lipase from Pseudomonas cepacia could reach 32.935 U/mL.

Key words： Pseudomonas cepacia； poly butylenes succinate （PBS）； lipase； optimization

收稿日期：2013-05-10

基金项目：陕西科技大学创新科研团队基金项目（TD10-01）；陕西科技大学研究生创新基金项目

作者简介：王旭愿（1990-），女，陕西西安人，在读硕士研究生，研究方向为微生物降解高分子材料，（电话）15309242538（电子信箱）

xuyuanguo15@163.com。

众所周知，大多数的传统塑料难以降解，且不易回收利用，其造成的环境污染引起了社会各界的广泛关注[1，2]。因此，人们投入了大量的精力去研究开发可生物降解的环境友好型材料，聚丁二酸丁二醇酯（PBS）具有良好的生物降解性和力学性能，因而受到了极大的关注[3-6]。PBS废弃后，在土壤微生物的作用下，可降解为低分子量物质，最终降解为对环境无污染的CO2和H2O[7]。在PBS的生物降解过程中，虽然其行为是由微生物主导，但直接起降解作用的是微生物代谢过程中所产生的脂肪酶，即在脂肪酶的作用下，PBS主链中的酯键发生水解断裂进而发生降解[8]。因此，提高微生物代谢生产脂肪酶的能力对于促进PBS降解，提高PBS降解速度有着十分重要的作用。

本研究是从洋葱假单胞菌出发，对1株代谢脂肪酶的菌株进行了培养基和发酵条件的优化，以提高其可降解PBS脂肪酶的代谢产量和活力，为后续微生物降解PBS基共聚物的研究提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌种

试验于2012年12月至2013年3月在陕西科技大学教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室进行。洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）由本实验室自主分离筛选并鉴定保存。

1.2 培养基

菌种保存培养基：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 0.5 g、NaCl 0.5 g、琼脂2 g、蒸馏水100 mL、pH 7.0。

菌种活化培养基：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸馏水 100 mL、pH 7.0。

基础发酵培养基：菜子油 1 g、（NH4）2SO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、KH2PO4 0.05 g、K2HPO4 0.05 g、蒸馏水 100 mL、pH 8.0。培养基于121 ℃下灭菌20 min备用。

将洋葱假单胞菌菌种接种到斜面保存培养基上，于37 ℃培养箱中培养24 h，然后用接种环挑取菌体接于活化培养基中，置于35 ℃，130 r/min摇床上培养24 h后，按6%接种量接入基础发酵培养基中，在250 mL锥形瓶中装100 mL基础发酵培养基，在同样条件下培养48 h。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶活性的测定 以酶活力为检测指标，将培养48 h后的发酵液于3 000 r/min下冷冻离心分离12 min，除去菌体，取其上层清液即粗酶液，于4 ℃下保存备用。采用Rashid N p-nPP比色法[9]测定发酵液中脂肪酶的活性。在上述条件下，每分钟水解产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活单位（U）。

1.3.2 洋葱假单胞菌产酶条件的单因素试验 从基础发酵培养基出发，研究不同碳源、氮源、培养温度、培养基初始pH、摇床转速、接种量、乳化剂及乳化剂含量对洋葱假单胞菌产脂肪酶的影响，并对其进行分析比较。

1.3.3 培养基优化正交试验 根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验优化发酵培养基各组分，正交试验设计因素和水平见表1。

1.3.4 发酵条件优化正交试验 根据单因素试验结果，选择接种量、温度、摇床转速和培养时间这4个发酵影响因素，采用L9（34）正交试验优化发酵条件，正交试验设计因素和水平见表2。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同碳源对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 假单胞菌能利用的碳源种类很多[10]，本试验中选取了7种物质分别作为发酵培养基的惟一碳源。如图1所示，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的最适碳源为菜子油，以菜子油为碳源时洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性最高，并且在3组平行试验中，脂肪酶活性相差不大，说明以菜子油为碳源时洋葱假单胞菌产酶量及酶活性较高且相对稳定，所以确定采用菜子油作为发酵培养基的碳源。

2.1.2 不同氮源对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 氮素对微生物的生长发育有着重要意义，微生物利用氮素在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质、核酸等细胞成分[10]。从图2可以看出，以酵母膏为氮源时，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性最高，而其他7种物质作为氮源时，酶活性均低于酵母膏为氮源时的酶活性，所以采用酵母膏作为洋葱假单胞菌发酵培养基的氮源。

2.1.3 不同培养温度对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 培养温度的变化能够影响微生物体内许多生化反应，从图3中可以看出，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性随温度的升高呈先增加后减小的趋势，在培养温度为35 ℃时脂肪酶活性达到最高。说明在培养温度较低时，微生物生长缓慢，其新陈代谢作用所分泌的胞外脂肪酶量较小，而当培养温度高于最适培养温度时，微生物细胞功能急剧下降，易于衰老和死亡。

2.1.4 不同培养基初始pH对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 环境的酸碱度与微生物的代谢生长和产酶关系密切，pH影响微生物原生质膜所带电荷的极性和渗透性等。由图4可知，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性随pH的增大呈先增加后减小的趋势，且在培养基pH为8.5时活性达到最高。由此可知，洋葱假单胞菌代谢的脂肪酶为碱性脂肪酶，这与国内外报道相符[11，12]。

2.1.5 不同摇床转速对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 摇床转速的大小直接关系到发酵液溶氧量的多少，氧含量是影响微生物生长的因素之一，不同的微生物对氧的需求量不同。如图 5所示，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性在摇床转速为140 r/min时活性最高，并且在3次平行试验中，脂肪酶活性相差不大，故其最适摇床转速为140 r/min。随着摇床转速的增大，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性呈先增加后减小的趋势。说明转速过低时，通气量小，影响菌体的生长繁殖，营养物质难以被有效利用，而当转速过高时，通气量又太大，生长繁殖过快，菌体易过早进入死亡期，产生的脂肪酶较少，因此脂肪酶活性差。

2.1.6 不同接种量对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 接种量和培养物生长过程的延缓期长短呈反比[13]，一般工业上会采用较大的接种量来缩短延缓期。增加接种量，实际上是利用生物的一种群体效应，即通过种内的相互关系（如种内互助），使之更快地适应新环境，缩短生长过程的延缓期，从而缩短发酵周期。如图6所示，随着发酵瓶中接种量的增大，洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性呈先增加后减小的趋势。洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性在接种量为9%时最高。在接种量较小时，微生物发酵周期较长，脂肪酶的产率较低；当接种量高于最适接种量时，菌丝密集，空间与资源相对匮乏，营养物质不能满足菌体的生长需要，导致菌体代谢过程受阻，从而不利于微生物发酵产酶。

2.1.7 不同乳化剂对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 乳化剂即表面活性剂，可以改善微生物细胞膜的通透性，使脂肪酶易于分泌到细胞外[11]，因此合适的乳化剂可提高生物的产酶量。从图7中可以看出，不同乳化剂对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的影响不同。向洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的培养体系中分别添加Tween-60、Tween-80、明胶、Trinton X-100、阿拉伯胶、橄榄油乳化剂及Tween-60与Span-80按质量比1∶1复配而成的乳化剂时，可以不同程度地使脂肪酶活性增加且更加稳定，其中Tween-60对其促进作用最大。添加Span-80和十二烷基磺酸钠时，对脂肪酶则表现为抑制作用。

2.1.8 乳化剂含量对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的影响 在发酵培养基中添加不同浓度的非离子表面活性剂Tween-60来提高细胞膜的通透性，如图8所示，在一定范围内添加乳化剂Tween-60，脂肪酶活性比未添加的对照有较大的提高。当添加量低于0.30%时，脂肪酶活性随添加量质量分数的增加而提高，在0.30%时达到最大；当继续加大Tween-60用量时，脂肪酶活性开始出现下降，这可能是大剂量的Tween-60对菌体产生了一定的毒害，影响微生物的正常代谢活动及产酶。

2.2 正交试验结果

2.2.1 基础发酵培养基主要成分正交试验结果 根据单因素试验结果，选择菜子油为碳源，酵母膏为氮源，Tween-60为乳化剂，培养基正交试验优化结果见表3。通过直观分析可知，影响洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的因素从大到小依次是A、C、B、D，即作为碳源的菜籽油对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性影响最大，其次是乳化剂，培养基初始pH影响最小，最优组合为A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化剂Tween-60 2.5 g/L，培养基初始pH 8.0。

2.2.2 发酵条件正交试验结果 发酵条件正交试验结果见表4。通过直观分析可知，影响洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的因素从大到小依次是H、E、G、F，即培养时间对脂肪酶活性影响最大，接种量次之，培养温度对酶活性的影响最小，所以选择脂肪酶活性最高的培养条件为接种量9%，培养温度35 ℃，摇床转速130 r/min，培养时间3 d，即E2F2G1H1。

3 小结

以洋葱假单胞菌为出发菌株，通过单因素和正交试验，得到洋葱假单胞菌生产脂肪酶的最优培养基组成为菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化剂Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培养条件为接种量9%、培养温度35 ℃、摇床转速130 r/min，发酵培养3 d。在此条件下，脂肪酶活性可达32.935 U/mL。同时，从发酵条件正交试验结果可以看出，适当延长培养时间对脂肪酶活力影响不大，但培养时间过长则会导致部分菌体丝自溶，培养基变黏稠，不利于脂肪酶的产生。

参考文献：

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[13] 王顺成，刘幽燕，李青云，等.产碱杆菌DN25的氰降解代谢途径分析与产酶条件优化[J].化工学报，2011，62（2）：482-489.

（责任编辑 赵 娟）

2.2 正交试验结果

2.2.1 基础发酵培养基主要成分正交试验结果 根据单因素试验结果，选择菜子油为碳源，酵母膏为氮源，Tween-60为乳化剂，培养基正交试验优化结果见表3。通过直观分析可知，影响洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的因素从大到小依次是A、C、B、D，即作为碳源的菜籽油对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性影响最大，其次是乳化剂，培养基初始pH影响最小，最优组合为A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化剂Tween-60 2.5 g/L，培养基初始pH 8.0。

2.2.2 发酵条件正交试验结果 发酵条件正交试验结果见表4。通过直观分析可知，影响洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的因素从大到小依次是H、E、G、F，即培养时间对脂肪酶活性影响最大，接种量次之，培养温度对酶活性的影响最小，所以选择脂肪酶活性最高的培养条件为接种量9%，培养温度35 ℃，摇床转速130 r/min，培养时间3 d，即E2F2G1H1。

3 小结

以洋葱假单胞菌为出发菌株，通过单因素和正交试验，得到洋葱假单胞菌生产脂肪酶的最优培养基组成为菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化剂Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培养条件为接种量9%、培养温度35 ℃、摇床转速130 r/min，发酵培养3 d。在此条件下，脂肪酶活性可达32.935 U/mL。同时，从发酵条件正交试验结果可以看出，适当延长培养时间对脂肪酶活力影响不大，但培养时间过长则会导致部分菌体丝自溶，培养基变黏稠，不利于脂肪酶的产生。

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（责任编辑 赵 娟）

2.2 正交试验结果

2.2.1 基础发酵培养基主要成分正交试验结果 根据单因素试验结果，选择菜子油为碳源，酵母膏为氮源，Tween-60为乳化剂，培养基正交试验优化结果见表3。通过直观分析可知，影响洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的因素从大到小依次是A、C、B、D，即作为碳源的菜籽油对洋葱假单胞菌代谢脂肪酶的活性影响最大，其次是乳化剂，培养基初始pH影响最小，最优组合为A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化剂Tween-60 2.5 g/L，培养基初始pH 8.0。

2.2.2 发酵条件正交试验结果 发酵条件正交试验结果见表4。通过直观分析可知，影响洋葱假单胞菌代谢脂肪酶活性的因素从大到小依次是H、E、G、F，即培养时间对脂肪酶活性影响最大，接种量次之，培养温度对酶活性的影响最小，所以选择脂肪酶活性最高的培养条件为接种量9%，培养温度35 ℃，摇床转速130 r/min，培养时间3 d，即E2F2G1H1。

3 小结

以洋葱假单胞菌为出发菌株，通过单因素和正交试验，得到洋葱假单胞菌生产脂肪酶的最优培养基组成为菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化剂Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培养条件为接种量9%、培养温度35 ℃、摇床转速130 r/min，发酵培养3 d。在此条件下，脂肪酶活性可达32.935 U/mL。同时，从发酵条件正交试验结果可以看出，适当延长培养时间对脂肪酶活力影响不大，但培养时间过长则会导致部分菌体丝自溶，培养基变黏稠，不利于脂肪酶的产生。

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（责任编辑 赵 娟）