VPA联合As2 O3对NB4细胞VEGF、NF-κB和MMP-9表达的影响

王陶然，张志华，王丽红，赵 蕾，朱松岩，郝长来*

(1.承德医学院附属医院血液病科，河北承德067000;2.承德市中医院超声科，河北承德067000)

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性白血病的一种。As2O3是治疗APL有效、安全的药物。As2O3应用早期可以诱导白细胞数急剧增长，导致白血病细胞的浸润，增加了患者治疗的危险性。有报道小剂量的As2O3诱导NB4细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)增 高［1－2］，VEGF能刺激肿瘤内皮细胞产生基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)，VEGF 及 MMP 的表达受NF-κB的调控，共同作用促进肿瘤的生长和浸润。丙戊酸钠(valproic acid，VPA)可通过调节VEGF的表达，从而抑制白血病细胞浸润、迁移［3］。本研究以NB4细胞为研究对象，观察VPA联合As2O3对VEGF、NF-κB 及MMP-9表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

NB4细胞系由中国医学科学院血液学研究所王建祥教授惠赠。VPA(Sigma公司)，用灭菌注射用水稀释为20 g/L和1 g/L的溶液，－20℃冰箱密闭避光保存，临用前用不含血清和抗生素的RPMI 1640液稀释至所需浓度。

1.2 细胞培养

NB4细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，同时加入青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 U/mL)，37 ℃、5%CO2，培养箱中培养。取对数增殖期细胞用于实验。

1.3 实验分组

将NB4细胞悬液调整为1×105个/mL，接种于培养瓶，每瓶10 mL，实验组分别加入1.0 mmol/L VPA、1.0μmol/L As2O3和1.0 mmol/L VPA+1.0μmol/L As2O3，对照组不加药。

1.4 MTI法检测药物抑制效应

NB4细胞以104个/孔接种于96孔培养板中;加入不同浓度的药物，并设3个复孔;37℃、5%CO2分别培养 24、48和 72 h后，加入 MTT溶液10μL/孔;继续培养4 h后，加入三联液(10%SDS+5%异丁醇 +0.012 mol/L HCl)100μL/孔，于37℃放置过夜后，酶标仪检测各孔540 nm处吸光度值，另设空白对照组、细胞对照组和药物实验组，实验数据为3次实验结果的平均值。存活率(%)=实验孔A值/对照组A值×100%。

1.5 基因表达的检测

按Trizol试剂盒说明书操作方法提取总RNA。用紫外分光光度计在260 nm和280 nm处测A值，A260/A280在1.8～2.0，根据 A260值计算 RNA浓度。按反转录试剂盒操作说明将RNA反转录成cDNA，以cDNA 为模板，分别用 VEGF、NF-κB、MMP-9 和β-actin的引物进行PCR扩增。以β-actin作为内参照(285 bp、621 bp)。VEGF上游引物:5'-GAAGTG GTGAAGTTCATGGATGTC-3'，下游引物:5'-CGAT CGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3'，扩增产物为409 bp。NF-κB 上游 引物:5'-CCGCTTAGGAGGGAGAGCC-3'，下游引物:5'-TATGGGCCATCTGTTGGCAGTG-3'，扩增片段为193 bp。MMP-9上游引物:5'-GGAGA CCTGAGAACCAATCTC-3'，下游引物:5'-TCCAATA GGTGATGTTGTCGT-3'，扩增片段为 296 bp。PCR反应条件:预变性95℃ 5min、变性95℃ 45 s、退火58℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，38个循环，终延伸72℃ 8 min。取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙啶)，80 V电泳30～50min，凝胶成像系统照相，用图像分析系统检测其吸光度(A)值，与内参β-actin的A值的比值来显示结果。

1.6 蛋白表达的检测

用RIPA裂解液裂解各组细胞提取总蛋白质(50 mmol/L)Tris-HCl pH 8.0、1%NP-40、150mmol/L NaCl、0.5%去氧胆酸钠、0.1%SDS)，用细胞核蛋白质提取试剂盒按说明提取各组细胞细胞核蛋白质，以BCA蛋白定量测定法检测蛋白浓度，每一样品取30μg，按比例(4∶1)加入5×上样缓冲液，至水浴箱中变性10 min。蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗稀释液中4℃孵育过夜，洗膜3次后，二抗稀释液中室温孵育1 h，洗膜后加入ECL试剂反应1 min，用X线片曝光，对底片上的显影条带进行计算机吸光度扫描定量。以β-actin条带作为总蛋白内对照，以Lamin B条带作为核蛋白内对照。

1.7 统计学分析

每个实验至少重复3次，结果采用SPSS17.0统计学软件处理，多组间采用方差分析及LSD-t检验。

2 结果

2.1 不同处理组对NB4细胞系存活率的影响

单用As2O3组细胞存活率比对照组降低;As2O3联合VPA组较单用As2O3组细胞存活率下降(P＜0.05)(图1)。

2.2 NB4细胞VEGF、NF-κB 和MMP-9的表达

As2O3组 VEGF、NF-κB 和 MMP-9 mRNA 和蛋白相对表达量显著高于对照组(P＜0.05)。单用VPA组无差异。而 As2O3+VPA 组 VEGF、NF-κB和MMP-9 mRNA和蛋白的表达低于单用As2O3组(P ＜0.05)(图2，表1)。

图1 VPA联合As2 O3对NB4细胞存活率的影响Fig 1 VPA and As2O3 treatment group on the influence of the cell survival rate±s，n=3)

图2 NB4细胞VEGF、NF-κB和MMP-9 mRNA和蛋白的表达Fig 2 VEGFm RNA and protein expressions of NB4 cell line

表1 NB4细胞VEGF、MMP-9及NF-κB的表达Table 1 VEGF，MMP-9 and NF-κB expressions in NB4 cell±s，n=9)

表1 NB4细胞VEGF、MMP-9及NF-κB的表达Table 1 VEGF，MMP-9 and NF-κB expressions in NB4 cell±s，n=9)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with As2 O3．

058 065 As2O3 0.426±0.012* 0.340±0.007* 0.832±0.049* 0.520±0.030* 1.250±0.043* 0.648±0.078*VPA+As2O3 0.129±0.007# 0.152±0.003# 0.236±0.023# 0.124±0.006# 0.223±0.011# 0.328±0.019#

3 讨论

As2O3是治疗APL安全、有效的药物。但在临床上As2O3存在早期诱导分化阶段白细胞数急剧增长，白血病细胞的浸润增加了病人治疗的危险性。研究发现，白血病细胞浸润现象与 VEGF有关，VEGF能够刺激MMP-9的合成和分泌，而核因子-κB(NF-κB)的活化在该途径中起着关键性的作用［4］。

本实验结果显示As2O3作用于NB4细胞48 h后VEGF、NF-κB、MMP-9表达较对照组增加。根据这一结果推测小剂量As2O3在治疗血液肿瘤的同时还伴有一定程度的诱导细胞增殖和侵袭的作用，可能机制为NF-κB的活化促进VEGF及MMP-9的表达，共同作用促进肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤的生长和浸润［5－6］。如何减轻As2O3的不良反应而不影响其疗效，是临床工作者和科研人员面临的一个重要问题。联合用药，多靶点治疗是肿瘤防治的新策略。

VPA的抗肿瘤治疗已经成为其应用的新领域，它能够抑制肿瘤血管生成［7］，使肿瘤细胞因缺血、缺氧而部分死亡，从而延缓肿瘤生长和抑制肿瘤转移。这种抑制作用是通过VEGF介导的信号系统完成的。

本实验研究发现加用VPA后VEGF、NF-κB及MMP-9的表达均较单用As2O3时明显降低。VPA通过影响NF-κB的核转录，抑制NF-κB依赖的启动子活性，抑制VEGF的生成，降低MMP的表达，从而延缓肿瘤生长和抑制肿瘤转移［8］。

通过本研究证实，VPA联合小剂量As2O3可使NB4细胞存活率降低并降低单独应用As2O3导致的NB4细胞VEGF、NF-κB及MMP-9表达增高。说明VPA能够降低As2O3的不良反应，这对临床提高应用As2O3治疗APL患者的疗效，探讨联合治疗具有重大意义。

［1］ Negaard HFS，Iversen N，Bowitz-Lothe IM，et al．Increased bonemarrow microvascular density in haematologicalmalignancies is associated with differential regulation of angiogenic factors［J］．Leukemia，2008，23:162 －169．．

［2］Kini AR，Peterson LAC，Tallman MS，et al．Angiogenesis in acute promyelocytic leukemia:induction by vascular endothelial growth factor and inhibition by all-trans retinoic acid Presented in partat the American Society of Hematology meeting，New Orleans，LA，December 1999［J］．Blood，2001，97:3919－3924．

［3］王丽红，张志华，赵蕾，等．丙戊酸抗裸鼠Kasumi-1细胞移植瘤血管新生的作用研究［J］．中国实验血液学杂志，2013，21:73 －79．

［4］许晓巍，许小平，易克，等．地塞米松对三氧化二砷诱导淋巴瘤细胞凋亡与NF-κB活化及相关表达的影响［J］．中华血液学杂志，2005，26:227－231．

［5］ Hicklin DJ，Ellis LM．Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis［J］．JClin Oncol，2005，23:1011 －1027．

［6］Bauvois B，Dumont J，Mathiot C，et al．Production ofmatrixmetalloproteinase-9 in early stage B-CLL:suppression by interferons［J］．Leukemia，2002，16:791 －798．

［7］ Deroanne CF，Bonjean K，Servotte S，et al．Histone deacetylases inhibitors as anti-angiogenic agents altering vascular endothelialgrowth factor signaling［J］．Oncogene，2002，21:427－436．

［8］Jeon HW，Lee YM．Inhibition of histone deacetylase attenuates hypoxia-induced migration and invasion of cancer cells via the restoration of RECK expression［J］．Mol Cancer Ther，2010，9:1361 －1370．