辽东楤木皂苷分布特性的研究

黄福山，赵恒田*，周克琴，李富恒，张渴望

(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081；2.黑龙江省林下经济资源研发与利用协同创新中心，黑龙江 哈尔滨 150081；3.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030)

辽东楤木[Araliaelata(Miq.) Seem.]，又称龙牙(芽)楤木，俗称刺龙牙、刺嫩芽、刺老鸦、东北野香椿等，是一种食药兼用型的五加科(Araliaceae)楤木属(Aralia)植物，为多年生落叶小乔木[1]。其食用器官为嫩芽，富含多种维生素、氨基酸和微量元素等，是深受国内外人们喜食的野生蔬菜[2]；国内外学者对辽东楤木植株的化学成分、药用价值和药理的研究较多，主要集中在对根皮、茎皮的研究[3-6]，对植株中有效活性成分三萜皂苷的分布特性报道较少，近年来对叶片的化学成分研究逐渐深入[7]，且叶片生长快速、再生能力强、总量多，是未来开发的重要原料。研究表明，辽东楤木的根、茎、叶等器官中均含有多种三萜皂苷[8-10]，主要皂苷元为齐墩果酸类化合物[11]，其可以作为生产中药制剂的原料，具有增强体质、抗除疲劳、抗炎保肝、降血糖血脂、抗癌、抗病毒等功效。同其他药用植物一样，辽东楤木植株有效活性成分及含量因分布区域、生长季节及植株生理状态等不同而有较明显差别。本实验通过分析辽东楤木植株的不同器官和部位，以及不同生育时期和光照条件下的叶片皂苷含量变化，揭示辽东楤木皂苷分布特性，为确定最佳的药源采集部位和采集时间，实现高效合理地利用辽东楤木资源提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KH-250DV型台式数控超声波清洗器(功率250 W，频率40 kHz，昆山禾创超声仪器有限公司)；RE-2000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；恒温水浴锅(余姚市亚星仪器仪表有限公司)；JM5702型号电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司)；植物粉碎干磨机。

1.2 材料

样品采自中国科学院东北地理与农业生态研究所(哈尔滨市)野生种质园，由中科院东北地理与农业生态研究所研究员鉴定为辽东楤木[Araliaelata(Miq.) Seem.]。辽东楤木1～2年生植株不能结实，高约1.5～2.5 m，直径约2～3 cm；3年及以上植株为结实植株，高约2.5～5 m，直径约3～9 cm。植株的生长环境为中温带大陆性季风气候，四季较分明，年平均气温3.5 ℃；≥10 ℃积温为2 000～3 200 ℃，全年日照时数2 600～2 900 h；年平均降水量约为350～650 mm；年平均蒸发量为659.8 mm；栽培土壤为中厚层黑土，养分丰富，有机质含量为50.64 g·kg-1，pH值6.8。

齐墩果酸标准品购自中国药品生物制品检定所；无水乙醇、乙醚、正丁醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均为分析纯；水为蒸馏水。

2 方 法

2.1 试验处理

选取1～8年植株的根和茎的皮部及叶片(8月中旬采集)，测定其皂苷的含量；选择2、4年株龄植株分别剥取根和茎的皮部、木质部和髓，测定各部位中皂苷的含量；选择2、4年株龄植株的不同生育期的叶片，每15天取一次样，测定皂苷含量，分析不同时期的叶片中皂苷的积累特点；采用黑色遮阳网对辽东楤木植株进行不同遮光处理，使其透光率分别为25%、50%、75%、100%，每30天取一次样，共取样4次，测定其中的皂苷含量，分析光照条件对叶片皂苷积累的影响。

将样品采集后，置于烘箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，干燥器中保存，备用。

2.2 皂苷含量的测定

辽东楤木皂苷提取及含量分析采用超声提取比色测定法[12]。

2.2.1 标准曲线的绘制

称取齐墩果酸标准品10 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，制成浓度为1.0 mg/mL的齐墩果酸标准溶液。

吸取齐墩果酸标准溶液20、40、60、80、100、120 μL，分别加入6支干燥具塞试管中，70 ℃水浴挥干甲醇，各加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60 ℃恒温水浴中加热15 min，取出，流水冷却5 min，加冰醋酸5 mL，摇匀，随行试剂空白，在540 nm波长处测定吸光度。3次平行重复，以3次吸光度的平均值为纵坐标，齐墩果酸标准品含量为横坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为：y=0.005x+0.006 2，R2=0.998 5，在20.0～120.0 μg 范围内线性关系良好。

2.2.2 楤木皂苷含量的测定

精密称取辽东楤木样品粉末0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入70%乙醇溶液20 mL，超声提取(超声温度为60 ℃，超声频率为40 kHz，超声功率250 W)60 min，提取液过滤后浓缩蒸干，加水30 mL，加入乙醚30 mL脱脂3次，然后用水饱和正丁醇20 mL萃取3次，合并正丁醇萃取液浓缩蒸干，残渣用甲醇溶解并移至10 mL容量瓶中，定容，摇匀即得供试品溶液。

精密吸取供试品溶液20 μL加入到干燥具塞试管中，水浴挥干甲醇，各加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60 ℃恒温水浴中加热15 min，取出，流水冷却5 min，加冰醋酸5 mL，摇匀，随行试剂空白，在540 nm波长处测定吸光度。由线性回归方程计算齐墩果酸的含量，根据齐墩果酸与楤木皂苷 A、B、C的相对分子质量之比进行换算[13]，得出样品中的楤木皂苷量。皂苷含量=样品溶液中皂苷量(mg)/样品质量(g)×100%。

3 结果与分析

3.1 植株不同器官皂苷分布

根皮、茎皮和叶片中均含有楤木皂苷(图1)，同一时期采集的根皮和茎皮中的皂苷含量随株龄的增加而增加，皂苷含量增幅较为平稳，根皮中皂苷含量高于茎皮；叶片中皂苷含量在1～6年株龄范围内呈增长趋势，6年生植株叶片皂苷含量最高，为8.9%，8年植株叶片中皂苷含量高于2年生植株叶片，但低于4～6年植株叶片；1～6年植株的根皮中皂苷含量最高，其次为叶片，茎皮中皂苷含量相对最低。

图1 不同株龄植株皂苷分布

图2 根和茎不同部位皂苷含量

3.2 植株不同部位皂苷分布

在根和茎的各部位中(图2)，皮部、木质部和髓的皂苷含量均表现差异显著。皮部中皂苷含量最高，木质部次之，髓中最低。同龄植株的各部位中，茎皮部中皂苷含量约是木质部的3.4倍，根皮部中皂苷含量是木质部的4倍以上。4年植株根和茎的皮部和木质部中皂苷含量均高于2年植株，但髓中的皂苷含量低于2年植株。

3.3 不同叶龄叶片皂苷动态变化

不同生长发育时期的叶片中皂苷含量变化较大(表1，图3)，2年植株的叶片皂苷含量随时间的延长呈先增加后减少趋势，6、7月份增长幅度较大，而后增幅趋于平缓，8月上中旬叶片皂苷含量最高，为6.9%，随后下降。4年植株叶片皂苷含量有两个高峰期，7月初和8月中旬皂苷含量较高，分别为8.1%和8.8%，7月中下旬为皂苷含量低峰期，可能是由于生殖生长的影响。在整个生长发育期间，4年植株叶片的皂苷含量均高于2年生植株叶片。

表1 辽东楤木生育期

图3 叶片中皂苷含量的动态变化

3.4 不同光照条件下叶片皂苷分布

不同光照条件下叶片皂苷含量随处理时间的延长均呈先增加后减少的趋势(图4)，在整个光照处理过程中，75%透光率和100%透光率(全光照)条件处理的叶片发育形态指标及皂苷含量基本一致，在整个生长发育期皂苷含量含量平均高于全光条件0.60%；50%透光率处理的叶片45天时皂苷含量与全光照条件差别不大，随着处理时间的延长，皂苷含量明显低于对照组；25%透光率处理的叶片皂苷含量在处理过程中均低于全光照条件，在生长发育末期叶片皂苷含量为2.86%，仅为全光照条件叶片皂苷含量的50%。叶片中皂苷的形成和积累需要足够的光照，75%透光率处理对皂苷的形成和积累影响较小，但对推迟叶片干枯脱落有一定好处，50%和25%透光率处理对叶片皂苷的积累无益，且会促使叶片提前干枯，亦不利于植株生长。

图4 不同光照条件下叶片皂苷含量变化

4 结论与讨论

植物的次生代谢是植物在长期进化中与环境相互作用的结果，次生代谢产物在植物提高自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系上充当着重要的角色，其产生和变化比初生代谢产物与环境有着更强的相关性和对应性[14-15]。药用植物在其生长发育的各个时期所含的药用成分和含量有很大差别，原因较为复杂，可能与不同的生长地点、生长季节、器官部位及本身的代谢生长发育特性等有关系，在初级代谢中间产物积累到一定程度并在调节次生代谢的酶促作用下，次生代谢产物含量才会出现高峰[16]。

辽东楤木根皮、茎皮和叶片是皂苷(次生代谢产物)的主要积累场所，以根皮中含量最高，叶片其次，茎皮含量相对少。根皮和茎皮中的皂苷含量积累规律相似，均逐年增长，这与前苏联和中国专家已有的报道[17-19]有相似之处，但在测定的皂苷含量方面有一定差异，可能是由于地域、气候和测定方法的差异造成的。在人工栽培条件下，辽东楤木第2～6年生长较快，植株高度增长约3.0～5.0 m，直径增长约2.0～4.5 cm，第6年之后植株高度增长较少，直径增长速度也变慢，很多植株生长6～8年时出现脱皮死亡现象，根部萌出新枝条，可能是衰老更替的一种表现，具体原因未见有报道。6年以上植株的根茎皮在皂苷含量和总量上都相对较高，最适宜作为药源材料。辽东楤木的叶片皂苷含量随株龄的增长呈增加趋势，4年以上植株成熟的叶片在大小、颜色差异小，皂苷含量较高，适宜作为药源材料；部分8年生植株受脱皮的影响，叶片出现黄化、卷曲等营养缺乏症状，皂苷含量相对低。

叶片中皂苷含量动态具有明显的季节变化规律，由枝芽萌发期到结果期，植物体生理活动活跃，叶片中营养物质积累迅速，皂苷类物质也有一定的增长和积累；随着叶片发育的不断成熟，外界温度的升高，酶的活性增强，光合能力增强，用于合成皂苷类物质的底物增多，皂苷类物质的生物合成作用也增强，在8月上中旬时，皂苷含量积累达到最高峰，此时叶片适宜作为药源材料，但采集量不宜过大，以免影响植物结实；4年以上植株叶片在7～8月皂苷含量有一个低峰，可能是由于生殖生长消耗大量的物质和能量的影响，皂苷合成减弱或发生转移；9～10月份，外界温度下降，光合作用和呼吸作用有所减弱，叶片逐渐变黄脱落，次生代谢物可能因内源的和外源因素的调节合成较弱或停止，也可能因发生转移或降解而损失。从不同光照条件下叶片的生长状况和皂苷含量变化看，辽东楤木属喜光植物，但也有一定的耐阴性，75%透光率的光照适宜叶片的生长和皂苷积累。目前，中药主要采用皂苷含量较高的根皮做为药源材料，此方法严重破坏资源，近些年在叶片中亦发现了更多的皂苷成分，药用价值显著，并且叶片再生能力强、总量多，根据叶片中皂苷的积累特点，适量采集8月中旬的叶片，能更充分合理的利用楤木资源。

参考文献：

[1] 班文杰,赵恒田.辽东楤木人工繁殖与栽培技术[J].中国野生植物资源,2008,27(3):61-63.

[2] 赵恒田,王新华,沈云霞,等.我国野菜资源人工开发利用及可持续发展[J].农业系统科学与综合研究,2004, 20(4):300-305.

[3] 宋少江,李丽,马志强,等.HPLC法测定辽东楤木根皮中楤木皂苷C的含量[J].沈阳药科大学学报,2006, 23(3):162-164.

[4] 王志才,张雷,陈燕萍,等.RP-HPLC法测定辽东楤木皂苷X的含量研究[J].东北师大学报，2009,41(1):92-94.

[5] SONG S J,NORIO N K ,MA C M,et al . Four new saponins from the root bark of Aralias elata[J]. Chem Phurm Bull ,2000 ,48(6) :838-842.

[6] Yoshikawa M, Murakami T, Harada E. Bioactive saponins and glycosides.Ⅶ. On the hypoglycemic principles from the root cortex of Aralia elata Seem: structure related hypoglycemic activity of oleanolic acid oligoglycoside[J]. Chem Phar m Bull (Tokyo) ,1996, 44(10) : 1923-1927.

[7] 张雷,王志财,郭明全,等.辽东楤木叶中3个皂苷的鉴定[J].中草药,2004,35(9):969-971.

[8] Masa Y K, Hisashi M T, Emiko H ,et al . A new hypoglycemic principle from the root cortex of Aralia elata seem structure-related hypoglycemic activity of oleanolic acid glycosides[J].Chem Phurm Bull, 1994 , 42(6) :1354-1356.

[9] Song S J, Norio N K ,Ma C M,et al. Four new saponins from the root bark of Aralia elata[J]. Chem Phurm Bull ,2000,48(6):838-842.

[10] Masa Y K, Hisashi M T , Emiko H. et al. Bioactive saponins and glycosides Ⅵ elatosides A and B,potent inhibitors of ethanol absorption,from the bark of Aralia elata Seem (Araliaceae): the structure-requirement in oleanolic acid glucuronide-saponins for the inhibitory activity[J]. Chem Phurm Bull,1996, 44(10):1915-1922.

[11] 钮旭升,马志强,宋少江，等.辽东楤木芽的化学成分研究[J].中医药学报.2009,37(3):52-54.

[12] 黄福山,赵恒田,李富恒.辽东楤木叶片皂苷超声提取工艺优化研究[J].食品工业科技.2012(6):360-362.

[13] 王丽君,姜虹.楤木属植物中皂苷含量的测定[J].北华大学学报,2005, 6(5): 419-420.

[14] Joseph P, Joan H. Effects of carbon dioxide , water supply and seasonally on terpene content and emission by Rosmarinus officinalis[J]. Journal of Chemical Ecology,1997,23(4):979-993.

[15] Shel T. Variable chemical defences in plants and their effects on herbivore behaviour[J]. Evolutionary Ecology Research, 2000 (2) : 231-249.

[16] 蔡凌云,石凤湘,付发琼,等.空心莲子草皂苷含量的动态变化[J].中药材,2011,34(3):352-354.

[17] 姜永涛,徐绥绪.龙芽楤木的研究进展[J].沈阳药学院学报,1991,8(3):229-233.

[18] Шретер Г.К. ,Бичиханов М.П.Содержание аралозидов в корнях аралии маньчжурской и особенности их накопления по фазам вегетации // Хим.- фармацевт.журн.1976. Т.10 ,No 9.С.78-82.

[19] Бабаш Т.А.,Шемерянкина М.Н.Количественное определение суммы аралозидов в корнях Aralia mandshurica //Хим.-фармацевт.журн.1983.Т.17,No 1.С.74-76.