RECK、MMP-14及MMP-2在喉癌中的表达与相关性研究

左文娜 王洪琴 吴干勋 李国丽 李丹

肿瘤转移抑制基因在恶性肿瘤的发生、发展和侵袭、转移过程中发挥着重要作用。基质金属蛋白酶(MMPs)属于重要的蛋白酶类之一，其可以降解多种细胞外基质成份和血管基膜，破坏肿瘤细胞的侵袭，促进血管形成。RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazalmotifs)基因是近年来新发现的一种新型肿瘤转移抑制基因和基质金属蛋白酶抑制剂，可抑制多种MMP表达，阻碍肿瘤细胞的发生、发展及侵袭。本研究对41例喉癌患者的石蜡标本采用流式细胞术检测并分析RECK基因和MMP-14、MMP-2在肿瘤组织中表达的相关性及与病理参数之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2009年12月至2011年1月收集的72例肿瘤组织，按类型不同分为喉癌组织41例、癌旁组织16例 (距肿瘤切缘＞0.5 cm)及喉部正常黏膜组织15例，分别为喉癌组、癌旁组及对照组。根据国际抗癌协会(UICC)TNM分类临床分期标准，Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期24例。喉癌组中男30例，女11例;根据术后病理，伴随淋巴结转移11例，未伴随30例;年龄40～76岁，中位年龄60岁;喉癌分型:声门上型21例，声门型15例，声门下型5例;病理学分级:G1组16例，G2组18例，G3组7例;吸烟量＞400(年×支/d)者20例，≤400(年 ×支/d)者21例;所有肿瘤组织均经组织病理学确诊为鳞状细胞癌、炎症或正常组织。且术前均未行放疗、化疗等治疗措施。

1.2 方法

1.2.1 制备单细胞悬液:将0.5 g组织放置于120目不锈钢网上剪碎，用镊子及0.9%氯化钠溶液轻轻搓洗至自然沉淀，收集细胞悬液。再次将混悬液过滤，去除细胞团块。1 000 r/min离心2 min，再次重复弃上清液。加入1 ml磷酸盐缓冲液悬浮细胞，制成单细胞悬液。

1.2.2 细胞的免疫荧光标记:取0.1 ml以上液体，按1∶100 浓度分别加入0.1 ml RECK、MMP-14 及 MMP-2抗体工作液，加入磷酸盐缓冲液10ml，同法离心5 min，弃上清液。之后加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液0.1 ml，常温孵育30 min，避光，荧光染色。上述方法重复一次后剔除未结合的荧光二抗。

1.2.3 REC基因及MMP-14蛋白检测:采用EPics-XLⅡ型流式细胞仪(美国Beckerman Coulter公司)、氩离子激光器、ExPo32ADC、Muticycle AN分析软件等对数据进行免疫荧光分析和拟合分析，调整仪器CV值＜2%。按照荧光指数(FI)对RECK、MMP-14蛋白及MMP-2蛋白的定量表达进行分析。公式为FI=实验样品均道值/正常组织均道值。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，同时采用单因素方差分析、SNK检验及直线相关及直线回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组RECK、MMP-14和MMP-2蛋白的表达 喉癌组织中RECK蛋白的表达量低于癌旁组及对照组(P均＜0.05)。癌旁组和对照组中RECK蛋白的表达量差异无统计学意义(P=0.063)。喉癌组织中MMP-14和MMP-2蛋白的表达量均高于癌旁组及对照组(P均 ＜0.05)。癌旁组和对照组中 MMP-14和MMP-2蛋白的表达量差异无统计学意义(P=0.763和P=0.895)。喉癌组织中RECK和MMP-14、MMP-2蛋白的表达与临床病理因素有关。见表1、2。

表1 各组RECK蛋白、MMP-14蛋白、MMP-2蛋白FI表达量比较±s

表1 各组RECK蛋白、MMP-14蛋白、MMP-2蛋白FI表达量比较±s

注:与喉癌组比较，*P ＜0.05

组别 RECK蛋白 MMP-14蛋白 MMP-2蛋白喉癌组(n=41)0.8173 ±0.1043 1.7135 ±0.1729 3.5987 ±0.1878癌旁组(n=16) 1.0926 ±0.1632* 1.3298 ±0.1427* 1.0322 ±0.1611*对照组(n=15) 1.1278 ±0.1322* 0.96787 ±0.7983* 0.6789 ±0.1657*

表2 喉癌组织中RECK在淋巴结转移、临床分期和病理分级中的表达量±s

表2 喉癌组织中RECK在淋巴结转移、临床分期和病理分级中的表达量±s

项目 RECK蛋白 P值 MMP-14蛋白 P值 MMP-2蛋白 P值淋巴结转移有(n=11) 0.5382 ±0.0934 1.8991 ±0.2152 4.1026 ±0.2008无(n=30) 1.1021 ±0.1415 0.036 1.4623 ±0.1856 0.012 2.7869 ±0.2035 0.041临床分期Ⅰ ～ Ⅱ期(n=17) 0.9169 ±0.1324 1.4112 ±0.1703 2.7589 ±0.1736Ⅲ ～ Ⅳ期(n=24) 0.6089 ±0.0714 0.024 1.7300 ±0.1579 0.030 3.9978 ±0.1876 0.003病理分级G1(n=16) 1.1022 ±0.1369 1.4213 ±0.2654 1.9326 ±0.1486 G2(n=18) 0.7533 ±0.0265 1.6849 ±0.2208 3.0120 ±0.2425 G3(n=7) 0.3148 ±0.0902 0.018 1.9538 ±0.2162 0.017 4.2386 ±0.1953 0.001

2.2 喉癌组织中RECK与MMP-14及MMP-2蛋白表达的相关性 RECK与MMP-14及MMP-2蛋白之间有显著的负相关线性关系，(r= －0.629，P＜0.05)及(r= －0.804，P＜0.05);喉癌组织中 MMP-14、MMP-2蛋白之间有显著的直线性相关关系，为正相关(r=0.612，P＜0.05)。见图1 ～3。

图1 RECK与 MMP-14呈负相关(直线回归方程是Y=2.002－0.601X)

图2 RECK与 MMP-2呈负相关(直线回归方程是Y=2.578－0.601X)

图3 MMP-14与 MMP-2呈正相关(直线回归方程是Y=1.302+0.671X)

3 讨论

MMP-2又称Ⅳ型胶原酶、明胶酶，是MMPs的家族成员之一，是肿瘤的侵袭和转移的过程中发挥重要作用的酶［1］。可以降解基底膜中的Ⅳ型胶原、明胶等，使基底膜断裂，破坏血管，使其完整性受到损害［2，3］。MMP-14/MTl-MMP 是 MT-MMP 家族中首位被发现的成员，其可启动细胞表面多个蛋白级联反应［4］。MMP-14和MMP-2有着密切关系，前者可以激活细胞膜上的 MMP-2，促进肿瘤生长［4］。

田振囡等［5］研究报道MMP-2和MMP-14在乳腺癌中高表达且表达与肿瘤大小和腋窝淋巴结转移呈正相关。江州华等［6］研究报道MMP2及MMPl4在胃癌中高表达，且与胃癌的浸润深度、淋巴管浸润、区域淋巴结转移及TNM分期有关。本研究表明，MMP-14蛋白与MMP-2蛋白在喉癌组织中高度表达，且与淋巴结转移、临床分期及病理分级有关，伴随淋巴结转移、临床分期晚、病理分级低时，MMP-14蛋白及MMP-2蛋白显高表达。提示MMP-14、MMP-2可促进肿瘤的生长，侵袭和转移。MMP-14可以作为临床上判断喉癌预后的指标。

RECK基因是日本学者Takahashi于1998年发现的，它可抑制MMPs的表达与活动，有关研究显示，有3中基质金属蛋白酶(MMPs)能被RECK调节:MMP-2、MMP-9和MMP-14，而在肿瘤侵润转移过程中涉及到的主要蛋白水解酶有MMP-2和MMP-9。膜锚定的RECK通过与 RECK结合并相互作用，使 MMP-2、MMP-9及MMP-14的活性受到影响，阻碍血管新生，诱导肿瘤细胞凋亡。

有学者发现，RECK与肿瘤预后密不可分，阳性表达患者的预后要优于阴性表达的患者，由此可以推断出高表达RECK可使肿瘤细胞的侵袭和转移受到阻碍［7］。周湘涛等［8］报道，RECK 在胃癌组织中低表达且与分化程度、浸润深度和有无淋巴结转移有显著相关性。张洁等［9］研究报道，RECK在非小细胞肺癌组织中的表达水平较非癌组织显著降低，RECK蛋白表达与TNM分期有密切关系。张天彪等［10］报道RECK蛋白在口腔鳞癌组织中的表达，明显低于正常口腔黏膜组织，与有无淋巴结转移、组织学分级及侵润程度有关。

由本研究结果可见:(1)相对癌旁组织与正常组织，RECK基因在喉癌组织中为低表达，提示其可能影响喉癌的发生。(2)RECK的表达在有淋巴结转移、临床分期越晚、病理分级越低的情况下为低表达，而与喉癌的临床分型无关，证明RECK参与并抑制了喉癌细胞的侵袭和转移，发挥了肿瘤转移抑制基因的作用。(3)RECK基因和MMP-14、MMP-2之间存在显著的负相关线性关系，说明RECK基因抑制喉癌侵袭和转移的机制有可能通过下调MMP-14及MMP-2蛋白的表达来实现，更深层次的机制尚待进一步研究。

综上，MMP-2蛋白和MMP-14蛋白在喉癌中的高表达且与临床分期、淋巴结转移、病理分化程度有关，可作为喉癌恶性程度的预测因子。RECK在喉癌组织中的表达低于癌旁组织及正常黏膜组织，RECK基因表达水平高的患者预后明显好于表达水平低的患者，说明RECK可能通过抑制MMPs从而抑制肿瘤的进展，这就提示我们可以通过运用上调癌细胞中RECK表达的药物或类似物来阻止肿瘤的侵袭及转移。

1 Taniwaki K，Fukamachi H，Komori K，et al.Stroma-derived matrix metalloproteinase(MMP)-2 promotes membrane type l-MMP dependent tumor growth in mice.Camcer Res，2007，67:4311-4319.

2 Wang A，Zhang B，Huang H，et al.Suppression of local invasion of ameloblastoma by inhibition of matrix metalloproteinase-2 in vitro.BMC Cancer，2008，8:182-185.

3 Toshimiehi A，Mitsuhiro T，Cheng SQ，et al.Prognnostic values of matrix metalioproteinase family expression in human colorectal carcinoma.Surg Ros，2008，146:32-42.

4 Koyama S.Enhanced Cell surface expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors and tumor-induced host response in progression of human gastric cancer.Dig Dis Sci，2004，49:1621-1630.

5 田振囡，李阳，胡杨，等.MMP-2、MMP-14在乳腺癌中的表达及临床意义.实用肿瘤学杂志，2010，24:4470450.

6 江州华，吴生华，李小强，等.Wnt5a、MMP2和MMPl4在胃癌中的表达及其对临床病理特征的影响.中国普外基础与临床杂志，2010，17:1077-1082.

7 Noda M，Takahashi C.Recklessness as a hallmark of aggressive cancer.Cancer Sci，2007，98:1659-1665.

8 周湘涛，庄英帜.MMP-9和RECK在胃癌中的表达及意义.临床医学，2011，24:46.

9 张洁，李雅莉，杨侠，等.RECK蛋自在非小细胞肺癌中的表达及其与MMP-9 的关系.陕西医学杂志，2012，41:1296-1298.

10 张天彪，许丹，关一夫，等.RECK和MMP-2在口腔鳞癌中的表达及其与侵袭转移关系研究.中国实用口腔杂志，2010，3:292-294.