PPARγ蛋白在人肺高、低转移涎腺腺样囊性癌细胞系中的作用

张炜 张玲 王绮 张虎 陈彦平

近年来的研究表明，肿瘤的发生发展是由癌基因和抑癌基因共同调控的。过氧化物增殖体激活物受体γ(peroxisome proliferator-activatived receptorsγ，PPARγ)是配体依赖性核激素受体超家族成员之一［1］。大量研究表明，不同部位、多种恶性肿瘤的PPARγ表达与相应的正常组织明显不同［2］，并且已有PPARγ配体抗肿瘤的临床试验研究，这些研究主要集中在乳腺癌，卵巢癌，结肠癌等［3］。目前关于PPARγ在口腔涎腺肿瘤领域相关性的研究极少，与恶性肿瘤远处转移的探索也很少。本研究从mRNA和蛋白水平研究PPARγ在涎腺腺样囊性癌SACC-83及SACC-LM细胞中的表达，探讨PPARγ与涎腺腺样囊性癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养 SACC-83及SACC-LM细胞系由北京大学口腔医学院口腔外科实验室提供。细胞加10%小牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，5%CO2饱和湿度的温箱中培养。

1.2 药物与试剂 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自美国Promega公司。PPARγ的引物(上游:5’-ATGGCAATTGAATGTCGTGTC-3’，下游:5’-TCCGCCCAAACCTGATG-3’)及管家基因 gapdh(上游:5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’，下游:5’-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’)购自上海生物工程技术公司。

1.3 RT-PCR反应 PCR反应在Biometra热循环仪中进行。PCR产物行210%琼脂糖凝胶(含0.125 μg/ml EB)电泳鉴定，反映 PPARγ mRNA 在SACC-83和SACC-LM细胞系中的表达。

1.4 实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法于 PCR 管 中 加 入 10 ×Buffer 215 μl，dNTP(215 mmol/L)，上游引物和下游引物各 1 μl，Taq DNA聚合酶 0.15 μl，DNA 模板 1 μl，2 × Eva(荧光染料)1 125 μl，ddH2O 25 μl。反应条件:95℃ 预变性 15 s;56℃退火20 s，72℃延伸30 s，循环40次;对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性，以PPARγ与GAPDH相对浓度的比值来反映PPARγ表达量。以检测肺高转移性涎腺腺样囊性癌(SACC-LM)及肺低转移性涎腺腺样囊性癌(SACC-83)细胞系中PPARγ蛋白表达和PPARγmRNA的表达水平。

2 结果

2.1 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果 通过RT-PCR检测在SACC-LM细胞中PPARγmRNA的表达水平高于SACC-83细胞。见图1。

图1 RT-PCR结果

2.2 实时定量(Quantitative Real-time)RT-PCR对RTPCR结果的验证 为了对RT-PCR的结果进行进一步验证，我们采用Quantitative Real-time RT-PCR的方法对同批RNA进行了检测。实验结果表明，QRT-PCR的结果与RT-PCR的结果一致。见表1。

表1 实时定量RT-PCR检测结果

3 讨论

腺样囊性癌是发生在涎腺最常见的恶性肿瘤之一，也是头颈部极易发生远处转移的恶性肿瘤，其远处转移率高达40%［4］。不少学者针对腺样囊性癌的转移做了大量的工作，但多为针对单一因素的探索，不能全面的反映肿瘤的转移的真实情况。PPARγ作为目前研究最成熟的核激素受体，有上百种天然及人工合成配体，部分配体已经应用于临床［5］，肿瘤转移的复杂性决定了转移是一个多基因共同参与的复杂过程，PPARγ在涎腺腺样囊性转移细胞系中的表达为研究肿瘤转移相关基因提供了条件。

近年来对于涎腺腺样囊性癌的研究多集中于病理学和免疫组化的方法。而本实验运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤转移细胞系，相比于病理学和免疫组化等方法有特异性高、灵敏度能够达到对单个分子的检测、准确性方面，尽管达不到100%的准确率，但却在原有方法基础上大大降低了假阳性率优点。

本部分研究采用RT-PCR技术比较了SACC-LM中PPARγ基因及蛋白水平表达均明显高于SACC-83。同时运用实时定量PCR(Quantitative Real-time RTPCR)技术进行验证，SACC-LM细胞系与SACC-83细胞系中 PPAR-γmRNA 表达水平比值为 4.346939∶1。我们从不同方法的实验证明，实验的结果表现为同步一致性。说明PPARγ在SACC远处转移方面起着重要作用。

口腔颌面部恶性肿瘤中，腺样囊性癌(ACC)极易发生远处转移。而转移性和侵袭性是恶性肿瘤的重要特征［6］，肿瘤若失去转移特性其恶性度将大大降低，对肿瘤转移相关基因的研究是攻克肿瘤不可缺少的重要基础工作之一。利用涎腺腺样囊性癌低转移细胞系(SACC-83)与高转移细胞系(SACC-LM)，对SACC的转移机制进行科学研究，探索核激素受体PPARγ与SACC转移的关系，进一步丰富对SACC转移的研究。

1 Issemann I，Green S.Activation of a Member of the Steroid-Hormone Receptor Superfamily by Peroxisome Proliferators.Nature，1990，347:645-650.

2 Wang TT，Xu J，Yu XF，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma in malignant diseases.Critical Reviews in Oncology Hematology，2006，58:1-14.

3 Han S，Roman J.Peroxisome proliferator-activated receptorγ:a novel target for cancer therapeutics?Anti-Cancer Drugs，2007，18:237-244.

4 Sung MW，Kim JW.Clinicopathologic predictorsand impact of distant metastasis from adenoid cystic cancinoma of the head and neck.Arch Otolarngol Head Neck Surg，2003，129:1193-1197.

5 Wei S，Yang J，Lee SL，et al.PPAR gamma-independent antitumor effects of thiazolidinediones.Cancer Letters，2009，276:119-124.

6 方伟岗.21世纪肿瘤侵袭转移研究面临的机遇和挑战.中华医学杂志，2001，81:193-194.