秦皇岛市替加环素对耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌体外抗菌活性研究

张晓玲 霍丽静 刘鹏 彭宗生

近年来，随着高产超广谱β内酰胺酶的肠杆菌科菌株占致病菌的比例逐年增高，作为应对该类细菌所致严重感染的最后一道防线——碳青霉烯类抗生素的临床使用也不断增加，催生出更多的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，肠杆菌科细菌在我国已迅速上升为院内感染的最重要的病原菌之一，给临床抗感染治疗带来了极大的挑战，替加环素作为新一代超广谱抗生素，于2005年6月得到美国食品和药品管理局(Food and Drug Adiministration，FDA)批准用于治疗成人复杂腹腔内感染和复杂的皮肤及软组织感染，是第一个被批准应用于临床的甘氨酰环素类抗菌药物。替加环素的作用机制主要是通过与核糖体30S亚基结合从而抑制蛋白质的合成［1］。体外药敏结果显示对甲氧西林耐药葡萄球菌、青霉素耐药肺炎链球菌、万古霉素耐药肠球菌及多数革兰氏阴性杆菌具良好的抗菌活性。随着替加环素在临床使用的增加，需要快速、准确的药敏结果指导临床合理使用该类抗菌药物。为了解其对CRE的体外抗菌活性，本研究回顾性收集秦皇岛地区三所大型医院2012年1月至2013年5月年临床分离出的110株亚胺培南或美罗培南耐药的肠杆菌科细菌，采用CLSI推荐的检测MIC的参考方法琼脂稀释法检测替加环素的MIC值，数据分析采用WHONET 5.6软件，以了解秦皇岛地区替加环素对CRE的体外药物敏感性，为该药在临床上的使用提供体外药物检测依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源:收集秦皇岛市三家大型医院临床分离的CRE共110株，1个患者只收集一次菌株，以保证菌株的不重复性。并记录患者的科室，病种，年龄，是否接受侵入性操作等基本情况。按照CLSI 2011年M100-S21中折点判定标准厄它培南MIC≥0.5 mg/L，美罗培南 MIC≥2.0 mg/L或亚胺培南 MIC≥2.0 mg/L，判定为耐碳青酶烯类药物菌株。

1.1.2 抗菌药物及培养基:抗菌药物标准品:替加环素标准粉(美国辉瑞制药有限公司，批号:L28832-6)储存于≦20℃冰箱内，避免反复冻融。美罗培南(住友制药)，亚胺培南(杭州默沙东制药有限公司)，厄他培南(杭州默沙东制药有限公司)。试验培养基为Mueller-Hinton琼脂(美国Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 MIC值测定:药敏试验严格按照2009年《新型甘氨酰环素类抗菌药物替加环素的体外药敏试验操作规程》［2］及CLSI推荐的琼脂稀释法测定替加环素对CRE的MIC值。根据《替加环素体外药敏试验操作规程专家共识》［3］，隔夜存放的M-H琼脂会使检测结果升高。所以本研究所使用的M-H琼脂均为当天新鲜配制。另外由于替加环素含多酚基团，理化性质活泼，易氧化降解或形成差向异构体，在光线及空气中久置会导致替加环素有效抗菌活性降低，影响检测结果。所以试验中配制M-H琼脂稀释的药物原液和稀释的过程要严格避光，尽量减少与空气解触的时间(黑布遮盖，加盖)。稀释好的不同浓度的含替加环素的MH培养基加橡胶塞密封置于培养箱中24 h观察结果。为保证结果的准确性同时用琼脂稀释法做质控菌的MIC值，质控菌结果在CLSI规定范围内，才可统计结果。

1.2.2 质控范围和折点判定:目前CLSI没有替加环素的药敏结果判定标准，只给出了替加环素药敏试验中质控菌株可接受的质量控制范围。本研究中CRE应用大肠埃希菌 ATCC25922的质控范围0.03～0.25 mg/L。另外，由于CLSI中尚无替加环素的MIC及折点判定标准，根据《替加环素体外药敏试验操作规程专家共识》，本研究中替加环素的折点采用FDA的折点判定标准:MIC≤2 mg/L为敏感，MIC≥8 mg/L为耐药，MIC=4 mg/L为中介。

2 结果

2.1 所收集的110株CRE的体外药敏结果 110株CRE中，耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌66株，占60.0%，对替加环素敏感率为80.3%。耐碳青霉烯类大肠埃希菌21株，占19.1%，对替加环素敏感率为95.2%。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌12株，占11.9%，对替加环素敏感率为91.7%。耐碳青霉烯类产气肠杆菌11株，占10%，对替加环素敏感率为81.8%。可见替加环素对CRE具备较高的体外抗菌活性。对耐碳青霉烯类大肠埃希菌更高达95.2%，对耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的敏感率也可达80%以上。见表1。

表1 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌对替加环素体外抗菌活性比较%

2.2 110株CRE对替加环素的体外敏感率分布 耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌，耐碳青霉烯类大肠埃希菌，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯和耐碳青霉烯类产气肠杆菌体外敏感率分布MICR50/90依次为1/4、1/2、1/2和1/4 mg/L。见表2。

表2 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌对替加环素的体外敏感率分布%

3 讨论

产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌在世界范围内的广泛播散已成为严重威胁公共卫生问题的重大事件。目前针对其耐药机制的研究、实验室检测以及感染控制研究已取得了重要进展并在不断深入。在CRE菌株的菌种分布方面，中国大陆以阴沟肠杆菌和产气肠杆菌最常见，其次为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌［4］。且碳青霉烯耐药阴沟肠杆菌的分离率呈逐年上升的趋势。秦皇岛三家收集的110株碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌中，耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌占66株。我们对66株阴沟肠杆菌的来源进行了统计分析，其中来源于ICU 39株、外科21、肿瘤科19株、呼吸科15株、CCU 9株神经内科4株、心内科2株。110株阴沟肠杆菌来源于尿路感染的38株，其中21例有导尿史。国内相关文献也有指出，减少侵袭性操作是CRE防控的重要措施。秦皇岛地区CRE的流行趋势不容乐观，给临床选择用药带来了极大的困难。

肠杆菌科细菌碳青霉烯耐药机制主要有两大类:一类是膜孔蛋白表达质和(或)量的的缺失导致抗生素摄取下降，同时合并对碳青霉烯类抗生素具有微弱水解活性的β-内酰胺酶的过表达。另一类是获得具有编码碳青霉烯类抗生素水解活性的碳青霉烯酶基因。其中肠杆菌科细菌中鉴定出的各种碳青霉烯酶分属于Ambler分类中的A类、B类和D类β内酰胺酶。其中A类中的KPC酶是目前最具临床意义的β内酰胺酶。近年来，对肠杆菌科细菌碳青霉烯耐药机制的研究已成为临床微生物领域关注的焦点。

替加环素作为一种半合成的四环素类药物，在米诺环素9位分子上添加叔丁基甘氨肽氨基团而衍生的一种新型四环素类抗生素。由于9位替代基团形成的空间位阻作用，使其与核糖体靶位的亲和性比米诺环素和四环素高5倍以上，且细菌对其不易产生耐药性［5］。替加环素不能激活四环素外排蛋白，因此微生物外排泵无法将甘氨酰四环素类药物排至胞外。正是由于它克服了获得性的核糖体保护tet(M)和主动外排tet(A-E)这两个临床上产生耐药性的机制，从而使细菌对替加环素产生显著耐药性的可能性很小，只有及其显著的突变才有可能导致细菌对替加环素的耐药。因而替加环素目前被认为是一种具有高效而广谱的抗菌活性的抗生素。

本研究显示，替加环素对CRE表现出较好的体外抗菌活性，对CRE的体外敏感率较高，成为仅次于多黏菌素的体外最有效的抗菌药物。由于该药在临床用药方便及与其它药物无交叉耐药，且肝肾毒性低等特点，使其在临床抗感染治疗中具有非常乐观的前景。同时，做好替加环素的体外药敏监测，为临床科学、合理、高效的使用此药提供支持，是临床细菌工作者需要做的一项重要工作。

1 杜小幸，王海萍，傅鹰，等.不同药敏方法检测替加环素对鲍曼不动杆菌敏感性的比较.中华检验医学杂志，2013，36:598-599.

2 王辉，倪语星，陈民钧，等.新型甘氨酰环素类抗菌药物替加环素的体外药敏试验操作规程.中华检验医学杂志，2009，32:1208-1213.

3 王辉，俞云松，王明贵，等.替加环素体外药敏试验操作规程专家共识.中华检验医学杂志，2013，36:584-587.

4 刘丁，张莉萍.肠杆菌科细菌碳青霉烯耐药机制研究与感控策略.中华检验医学杂志，2013，36:300-302.

5 张致平.抗耐药菌药物研究进展.中国抗生素杂志，2005，30:430.