肉苁蓉多糖对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及脑组织胆碱能系统的影响

尹刚，龚道恺，刘帮会，姚长江

·基础研究·

肉苁蓉多糖对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及脑组织胆碱能系统的影响

尹刚，龚道恺，刘帮会，姚长江

目的：探讨肉苁蓉多糖（CDPS）对阿尔茨海默病（AD）大鼠学习记忆能力及脑组织胆碱能系统的影响。方法：60只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组，每组10只，后4组采用Aβ1-40侧脑室注射制备AD大鼠模型，CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组在制模后分别每天以50、100、200 mg/kg CDPS灌胃，正常对照组及模型组以等量玉米油灌胃，假手术组以等量生理盐水灌胃，均灌胃28 d，进行Morris水迷宫检测，比色法测定皮质及海马乙酰胆碱酯酶（AChE）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）。结果：CDPS可缩短AD大鼠在Morris水迷宫的潜伏期，增加大脑皮质及海马AChE的含量，提高皮质中ChAT的活性。结论：CDPS可改善AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能与对胆碱能系统的影响有关。

肉苁蓉多糖；阿尔茨海默病；学习记忆；胆碱能系统

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是与年龄相关的进行性记忆丧失和高级认知功能减退的神经系统退行性疾病，其病理变化主要表现为细胞外聚集的β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积形成的老年斑、细胞内高度磷酸化Tau蛋白所致的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）,以及前脑基底胆碱能神经元的显著丢失。AD发病率占65岁以上人群的8%~10%，且正以每5年1倍的速度递增[1]。AD发生的确切机制目前仍未清楚，多数学者认为主要是脑内胆碱能系统受到损害，并提出了“胆碱能假说”：前脑基底胆碱能神经元的退变及大脑皮质和其他区域胆碱能递质的缺失是AD患者认知失常的主要原因[2]。研究表明，肉苁蓉的化学成分包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖和生物碱等，其中多糖是肉苁蓉的主要活性成分[3]。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有调节免疫、保肝、抗辐射及神经保护等作用[4]。本实验以Aβ1-40诱导制备AD大鼠模型，给予AD大鼠不同剂量肉苁蓉多糖（polysacchrides of cistanche deserticola，CDPS）后，观察大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase，AChE）、乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）的变化，探讨CDPS改善AD大鼠学习记忆能力及其对AD病因干预的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠 60只，体质量180~220 g，由华中科技大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 Aβ1-40（购于美国Sigma公司），将1 mg Aβ1-40溶于100 μL无菌0.9%氯化钠溶液中，制成5 μg/μL悬浮液，置于37℃恒温箱中孵育7 d，使其变为聚集状态的Aβ1-40，置于4℃冰箱备用。ChAT、AchE检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 CDPS的提取[5]肉苁蓉生药片1 kg，经热乙醇浸泡3 h后，用纱布过滤，弃滤液。药渣加水煎煮3次，每次1～2 h，过滤，合并滤液（呈棕红色）。蒸发浓缩后，离心去沉淀，上清液加2~3倍体积的95%乙醇沉淀，4℃静置24 h，次日于4℃离心20 min（6 000 r/min）收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥后获粗多糖（灰棕红色）。

1.2.2 动物分组及模型制备 大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组，每组10只。参照文献制备记忆功能障碍动物模型：大鼠腹腔注射水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，固定于脑立体定位仪，头顶部去毛，消毒皮肤，头顶部正中切口，暴露前囟，按大鼠脑立位图谱，于前囟后、中线右侧处，微量注射器自脑表面垂直进针，向侧脑室内缓慢注入2 μL Aβ1-40留针（假手术组注射等量生理盐水），以确保注射溶液充分扩散，后缓慢撤针，所有步骤均为无菌操作，皮肤切开处用青霉素抗菌，缝合伤口。CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组在模型制备后分别每天以低剂量（50 mg/kg）、中剂量（100 mg/kg）、高剂量（200 mg/kg）CDPS灌胃，正常对照组及模型组以等量玉米油灌胃，假手术组以等量生理盐水灌胃，连续28 d。

1.2.3 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫实验分别于术前7 d、术后7 d和术后28 d进行。测试主要完成定位航行试验，前2 d为适应期，每天上、下午分别进行2次，训练时依次将大鼠按顺时针方向由4个入水点放入水中，记录大鼠找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期（escape latensy，EL）。如果大鼠找到平台时间≤1 min，记录其实际EL；如果找到平台时间＞1 min，则由操作者将其引上平台并停留15 s，EL记录为1 min。

1.2.4 大鼠皮质海马组织ChAT及AchE活性测定 水迷宫实验完毕后，将大鼠颈椎脱臼法处死后取脑，分离出皮质和海马，称重后迅速置于－20℃冰箱中冷冻，加入预冷的生理盐水，冰浴制成10%匀浆。ChAT测定是以乙酰辅酶和胆碱为底物，在ChAT的作用下，反应的生成物和显色剂结合，在324 nm处测定吸光度，以此计算ChAT的活力，具体操作按照测定试剂盒进行。AchE水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可与巯基显色剂反应生成对称三硝基苯黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力，具体操作按照测定试剂盒进行。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 CDPS对AD大鼠学习记忆的影响

2.2 CDPS对大鼠海马和皮质组织AchE和ChAT活性的影响

在皮质和海马组织，与假手术组相比，模型组AchE活力升高，ChAT活力降低（<0.05），说明Aβ1-40对大鼠皮质和海马组织的AchE和ChAT有损害作用。CDPS能显著提高海马组织ChAT活性（<0.01）。CDPS可显著抑制海马组织的AchE活力（<0.01），见表1。

表1 各组大鼠EL、AchE和ChAT活性比较（±s）

注：与正常对照组比较，①<0.01；与假手术组比较，②<0.01；与模型组比较，③<0.01；与术后7 d比较，④<0.01；与假手术组比较，⑤<0.05

正常对照组 10 17.69±0.84 16.41±0.94 16.57±0.69 2.28±0.21 8.96±1.10假手术组 10 17.43±0.83 16.82±0.61 16.92±0.38 2.16±0.18 8.65±1.15模型组 10 18.15±0.65 46.18±1.04①② 45.52±0.93①② 1.23±0.14⑤ 3.65±0.68⑤CDPS低剂量组 10 18.44±0.45 44.64±1.53①② 25.39±1.22③④ 1.89±0.22③ 5.63±0.43③CDPS中剂量组 10 18.23±0.23 48.35±1.41①② 19.32±0.81③④ 2.45±0.41③ 7.86±0.61③CDPS高剂量组 10 17.43±0.36 46.21±1.52①② 15.42±0.19③④ 3.21±0.22③ 8.82±0.59③

3 讨论

AD发病的胆碱能假说认为，出现AD的病理过程时大脑基底前脑胆碱能神经元发生退行性病变，ChAT和AchE的活性改变，引起ACh的运输合成翻译摄取减少，导致学习与记忆力衰退[6]。研究表明AD患者脑内ACh合成分泌减少，其合成酶ChAT活性下降，且与痴呆严重程度密切相关，海马和皮质锥体细胞的突触、突触烟碱受体及突触前M受体均减少[7]，故学习记忆力降低与胆碱能功能紊乱关系最为密切。

本实验选用侧脑室立体定位仪注射Aβ1-40制作AD动物模型，结果提示侧脑室注射凝聚态Aβ1-40 7 d后大鼠出现学习记忆功能下降。崔丽霞等[8]报道侧脑室立体定位仪注射Aβ1-40大鼠第5天的EL明显延长、跨台次数明显减少，可见双侧侧脑室注射Aβ1-40均可使大鼠学习记忆能力下降，与本实验结果一致。在水迷宫实验中CDPS可明显降低大鼠EL，缩短到达平台时间，结果提示CDPS可改善大鼠认知功能。研究中发现大鼠侧脑室注射Aβ1-40后，皮质和海马组织ChAT降低，符合AD病理特征。CDPS能明显改善大鼠海马组织的ChAT活力，能抑制皮质和海马组织的AchE。

Ach是脑内重要的神经递质，胆碱能系统对于机体正常的认知功能发挥着重要功能。Ach在皮质和海马的缺失将导致学习记忆认知功能显著降低[9]。海马是大脑完成学习记忆最重要的部位，在空间记忆的获得储存提取中发挥重要作 用[10]。研究发现增加认知障碍患者海马Ach浓度后，认知和空间记忆功能均得到改善[11]。Ach合成的关键酶是ChAT，主要合成场所在胆碱能神经元细胞体，ChAT活性直接体现大脑胆碱能系统功能，ChAT活性提高可提高神经元面积和认知功能[12]。AchE可加快轴突生长，促进神经元细胞相互作用，促进轴突生长，改善多巴胺能神经元功能，促进β淀粉样肽沉淀形成[13]。CDPS不仅提高ChAT活性，还可减低AchE活性，显示其可能通过增加脑内Ach活性抑制Aβ1-40导致大鼠学习记忆功能障碍。

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（本文编辑：唐颖馨）

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.023

长江大学荆州临床医学院荆州市中心医院神经内科湖北荆州434020

湖北省教育厅优秀中青年人才项目（No.Q20101316）

2014-01-18

尹刚7706190@163.com