RhoA/ROCK信号通路在动脉粥样硬化发生中的作用

李南南，张军平，仲爱芹，吕仕超

(天津中医药大学1.研究生院;2.第一附属医院心内科，天津300073)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一个复杂的病理过程，表现为慢性进行性炎性反应、脂质沉积和管壁纤维化等，是引起死亡的许多疾病的病理基础，严重危害人类健康和生存质量。RhoA/ROCK通路参与AS 的发生发展过程，包括从内皮细胞的结构功能改变到斑块的形成与破裂。本文对有关RhoA/ROCK 信号通路及其在AS 发展中的作用机制作一综述。

1 RhoA/ROCK 通路构成

1.1 Rho 和ROCK 的基本特征

Rho 家族蛋白是一类广泛存在于所有真核组织中的具有GTP 酶活性的小G 蛋白，它们被形象的称为“分子开关”，在细胞的增生、凋亡和基因的表达等方面起着十分重要的作用［1］。Rho 蛋白受3 类因子(GEFs、GAPs 和GDIs)调节，GEFs、GAPs 控制Rho 两种状态的转化，而GDIs 结合Rho 蛋白作为其锚定装置调节特定部位的空间活性［2］。此外，亦有其他调节机制，如microRNA 参与Rho GTP 酶mRNA 的转录后调节;棕榈酰化和核定向影响其细胞内分布等［3］。

RhoA 是Rho 家族成员之一，其最主要的效应分子——ROCK 包括两种同工型:ROCK1 和ROCK2。结构上与其他许多激酶相似，ROCK 也有自抑制性的C 末端区域，包括RBD(Rho 结合区域)和PH 区域，静息状态下均能独立的与N 端的激酶区域结合，抑制激酶活性。

激活的GTP-RhoA 能够与ROCK 的RBD 区域结合，从而破坏激酶区域与C 末端区域的自抑制性结合，释放激酶活性。此外，一些脂类如花生四烯酸可与PH 区域结合，不依赖Rho 而激活ROCK;蛋白的低聚化也能调节ROCK 的活性，该机制可能是通过氨基末端的转磷酸作用。近来的研究表明［4］，其他的一些小GTPase 如Gem、Rad 和RhoE 表现出ROCK 的负性调控作用。

1.2 RhoA/ROCK 通路的下游底物

在细胞外界如血浆与溶血磷脂酸(LPA)［5］等刺激下，细胞募集并激活GEFs，GEFs 催化GDP 向GTP 的转化，活化状态的GTP-Rho 激活ROCK 使其表现出激酶活性并磷酸化多种下游底物，尤其是一些参与肌动蛋白纤维组装与收缩的相关蛋白，如肌球蛋白轻链(MLC)、肌球蛋白磷酸酶(MLCP)、LIM激酶(LIMK)和埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白复合体(ERM)等。

MLC 和MLCP 与细胞收缩密切相关，ROCK 能直接磷酸化MLC 的Ser19［6］，ROCK2 可磷酸化MLCP的Thr697、Ser854和Thr855［7］，抑制MLCP 对MLC 的去磷酸化作用，最终表现为MLC 磷酸化水平的增加和细胞收缩。

LIMK 是一类参与调节肌动蛋白骨架的激酶，能够磷酸化丝切蛋白(Cofilin)——一种肌动蛋白解聚蛋白，受LIMK 磷酸化后，Cofilin 活性受到抑制。ROCK 对LIMK 的磷酸化能增强其抑制Cofilin 介导的肌动蛋白骨架解聚作用，增加肌动蛋白骨架的数量。ROCK 还可激活并调节其他下游底物，如内收蛋白、ERM 蛋白复合体、GFAP 和NF-L 等［8］，在细胞中发挥不同的作用。

2 RhoA/ROCK 通路与动脉粥样硬化

AS 以内皮功能损伤为起始，引发内皮细胞激活和促炎性细胞聚集，活化的血小板沉积于损伤的内皮，释放多种细胞介质活化血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)和单核-巨噬细胞，致使VSMC 从肌层迁移到内膜层并增生产生大量基质，诱导单核-巨噬细胞的趋化和迁移，最终导致管壁对血浆中脂类物质的通透性增加，脂质沉积和巨噬细胞源性泡沫细胞及平滑肌细胞源性泡沫细胞的形成［9］。随着其他炎性细胞和脂类物质的不断增加，逐渐形成了脂质斑块和血管狭窄。

2.1 RhoA/ROCK 通路与内皮功能损伤

AS 炎性反应多个阶段均有RhoA/ROCK 通路的参与。内皮功能损伤即内皮一氧化氮合酶(eNOS)生物活性的减低，是AS 最早期的表现［10］。eNOS 在维持血管正常生理功能方面起着十分重要的作用，而ROCK 则通过多个途径下调eNOS 的表达与活性。

eNOS 的表达受转录水平和转录后水平调节，慢性缺氧和细胞增殖过程能够激活RhoA/ROCK 通路，而他汀类药物能够抑制该通路，增加eNOS mRNA 的稳定性。表明RhoA/ROCK 能够通过改变eNOS mRNA 的稳定性，负性调节eNOS 的表达。eNOS mRNA 的3'端非翻译区域复合物(3'UTR)能够通过与多种胞质蛋白的结合，调节其稳定性。由于RhoA/ROCK 通路与肌动蛋白骨架也能够调节eNOS mRNA 的半衰期，推测与3'UTR 相结合的胞质蛋白可能也是一类肌动蛋白骨架相关蛋白［11］。

此外，它还能直接调节eNOS 的活性，后者有赖于细胞内Ca2+浓度，及eNOS 相关蛋白和翻译后修饰。在抑制RhoA/ROCK 通路后，能引起PI3K/Akt的迅速激活及eNOS Ser1177 的磷酸化，表明除调节eNOS 的表达外，RhoA/ROCK 通路直接调节eNOS活性的潜在作用［12］。

2.2 RhoA/ROCK 通路与血管内皮通透性

内皮通透性包括细胞旁途径和跨细胞途径，均受机械力和生物信号的精确调节。在血管内皮细胞-细胞间不同的连接结构中，最重要的是紧密连接(tight junction)和黏附连接(adherens junction)，共同形成了细胞-细胞间的黏附和屏障。黏附连接存在于所有血管床中，尤其是外周微血管系统，其分子结构基础是血管内皮钙黏着蛋白(VE-cadherin)［13］。内皮细胞间通过VE-cadherin 连接，并与细胞内细胞骨架相通，形成内皮的紧密结构。黏着斑作为一种维持细胞屏障功能的骨架连接复合体，使内皮细胞固定于细胞外基质，维持其正常通透性。

多种炎性刺激信号分子均能与细胞表面相应受体结合，触发细胞内一系列的信号传导活动，破坏细胞间的连接结构，引起内皮通透性的相应改变。细胞内这一信号的传导可通过不同的途径发挥作用，RhoA/ROCK 在细胞肌动蛋白骨架、黏着斑的形成和非肌细胞的收缩方面起着关键的作用。生理条件下，血管机械力的变化通过RhoA/ROCK活化演变为细胞内信号，维持内皮完整性，尤其是细胞间连接结构。当受到凝血酶、VEGF 和嗜中性粒细胞等刺激时，血管内皮通透性增加与RhoA/ROCK 通路活性的升高密切相关［14］。RhoA/ROCK通过直接磷酸化MLC 或抑制MLCP 活性，使MLC磷酸化水平增高，引起细胞收缩，细胞与细胞分离形成细胞间隙，内皮通透性增高。也有研究表明这种作用只能导致暂时性的内皮细胞高通透性，其持久效应的维持可能与进一步的应力纤维和黏附斑的形成相关，但这些过程均依赖于RhoA/ROCK 通路的参与。RhoA 还能刺激Ca2+进入细胞内，作用于骨架蛋白和细胞连接结构，影响细胞旁途径通透性［15］。

2.3 RhoA/ROCK 通路与AS 斑块的形成和破裂

AS 发生发展过程中，VSMC 在各类炎性因子的刺激下，穿过动脉内膜迁移进入内皮下增殖，并分泌一系列促炎性反应分子，促进局部炎性反应的发展。纤维组织和增殖的VSMC 覆盖、包被内部脂质核，逐步形成粥样硬化性坏死，部分转变为平滑肌细胞源性的泡沫细胞。平滑肌细胞的迁移与增生促进了血管的重塑和狭窄损伤，VSMC 的迁移与覆盖增加了斑块的稳定性。当VSMC 缺失，动脉栓塞的风险也相应增加。

RhoA/ROCK 通路介导了VSMC 的增殖与迁移。与野生型小鼠相比，血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)诱导的VSMC迁移在ROCK1+/-小鼠中显著下降，但高浓度的PDGF 可以下调ROCK1/2，抑制VSMC 迁移［16］。ERK 核转位可以作为转录因子发挥调节作用，增加增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白的表达，促进VSMC 增殖，也可磷酸化肌动蛋白结合蛋白Palladin抑制细胞迁移，而ERK 的活性又受ROCK 调节［17］。一磷酸鞘氨醇(sphingosine I phosphate，SIP)是一种由血小板释放的参与调控AS 的鞘脂类代谢产物，在VSMC 与EC 的共培养实验中发现，高浓度的SIP激活RhoA/ROCK 信号通路，产生金属蛋白酶组织抑制剂因子TIMP-2，通过减少黏着连接的形成从而抑制细胞迁移效应［18］。在血管炎性反应与损伤的实验模型中也确定了ROCK 的激活。RhoA/ROCK还可通过参与AT1 受体激活诱导的细胞膜“出泡(membrane blebbing)”现象从而引起细胞迁移［19］。总之，RhoA 可以通过多个途径促进/抑制VSMC 迁移，在不同的生理或病理条件下所表现出的效应可能不尽相同，可能与黏着斑的形成有关，具体机制有待进一步研究。

另一种参与AS 斑块形成的重要细胞是单核巨噬细胞。局部炎性反应引发单核细胞在损伤部位的趋化与黏附，内皮下转变为巨噬细胞大量吞噬清除沉积的脂质，富含脂质的巨噬细胞逐渐演变为巨噬细胞源性泡沫细胞，该细胞发生坏死，便形成粥样斑块的一部分。在这种巨噬细胞源性泡沫细胞中，ROCK 活性显著增强。使用RocK1 基因敲除小鼠，病理模型中动脉粥样硬化损伤明显减轻，其部分原因与RocK1 缺乏的巨噬细胞黏附、脂质摄取、泡沫细胞形成的减少有关。ROCK 在巨噬细胞中这些作用的具体机制及RocK2 是否参与了该过程尚不清楚。临床观察中也发现在AS 患者中，ROCK 活性显著增高［20］。

RhoA/ROCK 通路还参与AS 形成过程的其他方面，如血栓形成及氧化应激等，但其具体机制有待进一步研究。

3 展望

越来越多的证据表明，RhoA/ROCK 通路在AS发生中起着重要作用，ROCK 活性检测有望成为心血管疾病新的诊断和预后指标，抑制RhoA/ROCK通路也许是心血管疾病一个潜在的治疗靶点。尽管ROCK 参与AS 的多个阶段，其中的许多分子机制并不清楚，并且ROCK 两种亚型各自在AS 中的功能差异尚不明确。这需要更具选择性的ROCK抑制剂或基因学方法特定敲除不同ROCK 亚型基因来研究其功能，进一步了解ROCK 下游的确切分子机制，同时需要大量、长期的临床试验为更安全有效的ROCK 抑制剂的临床应用提供依据。

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