血管抑素基因治疗Lewis肺癌移植瘤小鼠的实验研究

李真斌　齐协飞

【摘要】 目的：观察血管抑素基因对Lewis肺癌小鼠移植瘤生长、转移的抑制作用。方法：建立C57BL/6j小鼠肺癌模型，30只荷瘤鼠按照随机数字表法分为生理盐水空白对照组、阳离子脂质体对照组、血管抑素基因（PAng）治疗组，每组10只。以阳离子脂质体为介导，将血管抑素基因的重组质粒直接注入移植瘤内，每周3次，共5周，每周测瘤体大小1次，第7周末处死所有小鼠，观察瘤体大小变化、肺表面转移灶数、小鼠生存期等。结果：治疗组小鼠移植瘤生长速度减慢，瘤体缩小，肺内转移少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），小鼠活动能力、饮食、对外界刺激的反应能力均无明显改变，生存期明显长于对照组（P<0.05）。结论：阳离子脂质体介导血管抑素基因可有效地抑制Lewis肺癌移植瘤的生长、转移。

【关键词】 阳离子脂质体； 血管抑素基因； Lewis肺癌； 小鼠移植瘤

肿瘤的生长和转移与血管生成密切相关[1]。20世纪70年代初Folkman[2]首次提出肿瘤的生长、发展和转移依赖血管形成的观点。以肿瘤新生血管为靶点，抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤生长所需营养物质及转移途径，已成为近年来治疗肿瘤的新方法[3]。本文建立Lewis肺癌小鼠移植瘤动物模型，将血管抑素基因的质粒混合物直接注射于移植瘤体内，观察瘤体大小变化，移植瘤小鼠对外界的反应能力、饮食、营养状况、生存期等，同时计数肺表面肿瘤转移灶数，来评价血管抑素基因的抑瘤能力。

1 资料与方法

1.1 建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型 在无菌条件下取出Lewis肺癌种鼠的肿瘤组织，去除筋膜组织，配制成1×107/mL的细胞匀浆悬液，每只小鼠右腋皮下注射细胞悬液0.2 mL，建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型，室温下饲养[4]。

1.2 血管抑素基因的重组质粒及转染 取含血管抑素基因的质粒（PAng）（南昌大学二附院分子实验室保存）和SA脂质体，按质粒DNA与SA脂质体重量比为1：7混合，轻摇混合物，室温下静置20 min后进行试验[5]。

1.3 移植瘤小鼠分组及治疗 观察移植瘤瘤体生长，选择直径生长至8 mm左右成瘤小鼠30只，按照随机数字表法分为3组，每组10只。将SA脂质体-质粒DNA混合物用微量注射器进行瘤内注射治疗，3次/周，周一、周三、周五，共计5周。（1）生理盐水空白对照组：0.9%氯化钠60μL/次/只，（2）SA脂质体对照组：0.9%氯化钠10μL+脂质体50μL/次/只，（3）PAng治疗组：PAng10μL+脂质体50μL/次。

1.4 观察指标 （1）肿瘤体积的变化：实验期间，每周一用游标卡尺测量瘤体横直径，按v=ab2/2计算瘤体大小。（2）肺内转移灶数：实验结束后，取出死亡处或死后小鼠的肺脏计数肺表面肉眼可见的转移灶数，HE染色证实肺内转移。（3）一般情况：实验期间，观察小鼠对外界的反应能力及活动能力、饮食、营养状况等。（4）生存期：以小鼠接种癌细胞之日为起点，直至小鼠死亡或被处死时为止，计算每只实验小鼠生存天数。

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组治疗后小鼠移植瘤平均体积的比较 Lewis肺癌细胞悬液接种于C57BL/6j小鼠右腋皮下后3～5 d见生长出大小约2 mm肉眼所见肿瘤。两对照组瘤体呈生长迅速，坏死结痂直至小鼠死亡；PAng组治疗后第5天见移植瘤生长开始减慢，第15天后体积开始缩小，第22天PAng组平均体积为（156±8）mm3、与空白盐水对照组（5207±126）mm3及SA脂质体对照组（5436±131）mm3比较差异均有统计学意义（P<0.05），第5周末，PAng组有2只小鼠瘤体肉眼消失，见表1。

2.2 小鼠进食、营养、反应能力等变化 治疗组小鼠治疗前后活动能力，对外界刺激反应能力无明显变化，进食良好，营养状况较佳。对照组小鼠对外界刺激反应能力、活动能力逐渐变差，进食差，消瘦，渐呈恶病质，直至死亡。

2.3 三组肺内转移灶数目情况 两对照组小鼠肺脏肉眼所见色苍白，表面粗糙、凹凸不平，见较多鱼肉样结节样病灶，结节样病灶病理切片HE染色后，镜下见大量核大、深染、形状不规则肿瘤细胞（图1）。治疗组仅3只小鼠肺脏色粉红，表面光滑见数个较小结节样病灶，病理组织学仅见少许肿瘤细胞（图2），其他小鼠均未见明显病灶，病理组织学未见肿瘤细胞。

2.4 三组小鼠生存期比较 对照组小鼠在35 d内全部死亡，观察期结束PAng组死亡4只，第7周末处死所有小鼠。治疗组平均为45 d以上，与生理盐水空白对照组（30.1±3.2）d和SA脂质体对照组（33.5±2.9）d比较，生存期显著延长，差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

肿瘤的血管生成对肿瘤的生长及转移起关键性作用，当肿瘤体积达1～2 mm3时继续生长则必须依赖新省生血管形成[6]。肿瘤血管系统即为肿瘤细胞提供营养供给，同时调控着肿瘤的病理生理状态，如肿瘤的发展、侵入、转移，以及对各种治疗的响应[7]。抗血管生成治疗可使肿瘤血管网和微循环出至少暂时性的正常化趋势[8]。1994年，Reilly等[9]通过Lewis肺癌的小鼠实验研究从小鼠的血清中分离获得血管抑素（Angiost-atin），他对血管内皮细胞的迁移、增殖直接起抑制作用，促使肿瘤细胞休眠对肿瘤细胞无抑制作用，是最有潜力的血管生成抑制因子。而且所有肿瘤细胞的血管内皮细胞均相同或相似，抗血管治疗可针对所有实体瘤[10-11]。汪力慧[12]通过将血管内皮抑素直接瘤体内注射治疗Lewis肺癌的C57小鼠移植瘤，结果显示血管内皮抑素对移植瘤生长有明显的抑制作用，减少肿瘤肺转移率，其作用程度与内皮抑素剂量呈现明显正相关，且血管内皮抑素中未见获得性耐药现象发生，没有明显的毒副作用，但作用持续时间很短。石磊等[13]采用基因转染技术将真核表达载体导入人胰腺癌细胞，进行细胞培养，检测到转染细胞所分泌的血管抑素，进一步建立种植瘤模型，结果显示血管抑素转染组的种植瘤生长明显低于对照组，种植瘤微血管密度显著少于对照组，同时也表明基因转染有效可行，可有效转染目的基因，进而翻译表达出目的基因蛋白。孙平等[14]以阳离子脂质体为载体，构建血管抑素基因真核表达质粒，直接注射入瘤体，治疗人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究结果显示，基因治疗组肿瘤的生长速度和体积均低于空质粒对照组，表明血管抑素基因治疗确有抑制肿瘤生长的作用。黄春锦等[15]建立人胰腺癌细胞PC3裸鼠原位移植瘤模型，观察血管抑素基因对移植瘤生长和转移的影响，血管抑素基因对胰腺癌原位移植瘤模型裸鼠肿瘤生长和转移有抑制作用。本实验通过建立Lewis肺癌小鼠移植瘤，观察血管抑素基因对移植瘤生长和转移的影响，实验结果显示血管抑素基因治疗组移植瘤体积小于对照组，肺转移发生率较低，治疗组小鼠营养状况及活动能力良好，生活质量改善。endprint

抗血管生成治疗肿瘤目前还处于试验阶段，还有很多问题有待解决，如何种基因载体转载效率高，如何控制，是否存在剂量依赖关系，何种剂量最佳等。但本文为攻克恶性肿瘤提供了新的思路和方法，随着科技的进步，有望成为治疗肿瘤的新方法。

参考文献

[1] Folkman J，Haudenschild C. Angiogenesis in vitro[J].Nature，1980，288（5）：551-556.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis：therapuctic implication[J].N EngL J Med， 1971， 285（5）：1182.

[3]周清华.肺癌血管生成研究进展-肺癌基础研究与临床[M].北京：北京科学出版社，1999：116-155.

[4]刘馨，伍治平，等.小鼠Lewis 肺癌原位模型的构建[J].中国肺癌杂志，2010，13（5）：42-47.

[5]杨静平，孙玉英，林其谁.SA脂质体：高效介导DNA转染的新试剂[J].生物化学与生物物理学学报，1993，25（2）：231-237.

[6] Cai Y， Xu S X， Wu J， et al. Coupled modeling of tumour angiogenesis， tumour growth， and blood perfusion[J]. Journal of Theoretical Biology， 2011， 105（21）：1235-1239.

[7] Jain R K，Tong R T，Munn L L. Effect of vascular normalization by antiangiogenic therapy on interstitial hypertension， peritumor edema， and lymphatic metastasis： insights from a mathematical model[J].Cancer Res，2007，67（6）： 2729-2735.

[8]吴洁，丁祖荣，等.血管抑素与内皮抑素作用下抗血管生成治疗对肿瘤微血管网与微环境影响的模拟研究[J].应用数学和力学，2011，32（4）：417-427.

[9] Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al. Angiostatin：a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J]. Cell，1994，79（6）：315-328.

[10] Sim B K L，Macdonald N J，Gubish E R. Angiostatin and endoststin： Endogenous inhibitors of tumor growth[J]. Cancer Metastasis Review，2000，19（6）： 181-190.

[11] Troyanovsky B， Levchenko T， Mansson G， et al. Angiomotin： an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation[J]. The Journal of Cell Biology， 2001， 24（6）：136-139.

[12]汪力慧.血管内皮抑素对小鼠肺癌影响的研究[J].中国热带医学，2012，12（10）：1182-1184.

[13]石磊，岳媛.血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（6）：745-749.

[14]孙平，董典宁.血管抑素基因治疗人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究[J].现代妇产科进展，2007，16（5）：351-353.

[15]黄春锦，杜卫东.血管抑素基因对人胰腺癌细胞PC3裸鼠原位移植瘤模型生长和转移的影响[J].中国实用医药，2009，14（4）：251-253.

（收稿日期：2013-09-05） （本文编辑：黄新珍）endprint

抗血管生成治疗肿瘤目前还处于试验阶段，还有很多问题有待解决，如何种基因载体转载效率高，如何控制，是否存在剂量依赖关系，何种剂量最佳等。但本文为攻克恶性肿瘤提供了新的思路和方法，随着科技的进步，有望成为治疗肿瘤的新方法。

参考文献

[1] Folkman J，Haudenschild C. Angiogenesis in vitro[J].Nature，1980，288（5）：551-556.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis：therapuctic implication[J].N EngL J Med， 1971， 285（5）：1182.

[3]周清华.肺癌血管生成研究进展-肺癌基础研究与临床[M].北京：北京科学出版社，1999：116-155.

[4]刘馨，伍治平，等.小鼠Lewis 肺癌原位模型的构建[J].中国肺癌杂志，2010，13（5）：42-47.

[5]杨静平，孙玉英，林其谁.SA脂质体：高效介导DNA转染的新试剂[J].生物化学与生物物理学学报，1993，25（2）：231-237.

[6] Cai Y， Xu S X， Wu J， et al. Coupled modeling of tumour angiogenesis， tumour growth， and blood perfusion[J]. Journal of Theoretical Biology， 2011， 105（21）：1235-1239.

[7] Jain R K，Tong R T，Munn L L. Effect of vascular normalization by antiangiogenic therapy on interstitial hypertension， peritumor edema， and lymphatic metastasis： insights from a mathematical model[J].Cancer Res，2007，67（6）： 2729-2735.

[8]吴洁，丁祖荣，等.血管抑素与内皮抑素作用下抗血管生成治疗对肿瘤微血管网与微环境影响的模拟研究[J].应用数学和力学，2011，32（4）：417-427.

[9] Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al. Angiostatin：a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J]. Cell，1994，79（6）：315-328.

[10] Sim B K L，Macdonald N J，Gubish E R. Angiostatin and endoststin： Endogenous inhibitors of tumor growth[J]. Cancer Metastasis Review，2000，19（6）： 181-190.

[11] Troyanovsky B， Levchenko T， Mansson G， et al. Angiomotin： an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation[J]. The Journal of Cell Biology， 2001， 24（6）：136-139.

[12]汪力慧.血管内皮抑素对小鼠肺癌影响的研究[J].中国热带医学，2012，12（10）：1182-1184.

[13]石磊，岳媛.血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（6）：745-749.

[14]孙平，董典宁.血管抑素基因治疗人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究[J].现代妇产科进展，2007，16（5）：351-353.

[15]黄春锦，杜卫东.血管抑素基因对人胰腺癌细胞PC3裸鼠原位移植瘤模型生长和转移的影响[J].中国实用医药，2009，14（4）：251-253.

（收稿日期：2013-09-05） （本文编辑：黄新珍）endprint

抗血管生成治疗肿瘤目前还处于试验阶段，还有很多问题有待解决，如何种基因载体转载效率高，如何控制，是否存在剂量依赖关系，何种剂量最佳等。但本文为攻克恶性肿瘤提供了新的思路和方法，随着科技的进步，有望成为治疗肿瘤的新方法。

参考文献

[1] Folkman J，Haudenschild C. Angiogenesis in vitro[J].Nature，1980，288（5）：551-556.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis：therapuctic implication[J].N EngL J Med， 1971， 285（5）：1182.

[3]周清华.肺癌血管生成研究进展-肺癌基础研究与临床[M].北京：北京科学出版社，1999：116-155.

[4]刘馨，伍治平，等.小鼠Lewis 肺癌原位模型的构建[J].中国肺癌杂志，2010，13（5）：42-47.

[5]杨静平，孙玉英，林其谁.SA脂质体：高效介导DNA转染的新试剂[J].生物化学与生物物理学学报，1993，25（2）：231-237.

[6] Cai Y， Xu S X， Wu J， et al. Coupled modeling of tumour angiogenesis， tumour growth， and blood perfusion[J]. Journal of Theoretical Biology， 2011， 105（21）：1235-1239.

[7] Jain R K，Tong R T，Munn L L. Effect of vascular normalization by antiangiogenic therapy on interstitial hypertension， peritumor edema， and lymphatic metastasis： insights from a mathematical model[J].Cancer Res，2007，67（6）： 2729-2735.

[8]吴洁，丁祖荣，等.血管抑素与内皮抑素作用下抗血管生成治疗对肿瘤微血管网与微环境影响的模拟研究[J].应用数学和力学，2011，32（4）：417-427.

[9] Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al. Angiostatin：a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J]. Cell，1994，79（6）：315-328.

[10] Sim B K L，Macdonald N J，Gubish E R. Angiostatin and endoststin： Endogenous inhibitors of tumor growth[J]. Cancer Metastasis Review，2000，19（6）： 181-190.

[11] Troyanovsky B， Levchenko T， Mansson G， et al. Angiomotin： an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation[J]. The Journal of Cell Biology， 2001， 24（6）：136-139.

[12]汪力慧.血管内皮抑素对小鼠肺癌影响的研究[J].中国热带医学，2012，12（10）：1182-1184.

[13]石磊，岳媛.血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（6）：745-749.

[14]孙平，董典宁.血管抑素基因治疗人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究[J].现代妇产科进展，2007，16（5）：351-353.

[15]黄春锦，杜卫东.血管抑素基因对人胰腺癌细胞PC3裸鼠原位移植瘤模型生长和转移的影响[J].中国实用医药，2009，14（4）：251-253.

（收稿日期：2013-09-05） （本文编辑：黄新珍）endprint