南疆灰枣果皮蜡质成分初探

李述刚，白露，陆健康，许倩

（塔里木大学生命科学学院南疆特色农产品深加工兵团重点实验室,新疆阿拉尔843300）

红枣具有极高的营养保健价值及药用价值，素有“木本粮食、滋补佳品”的美誉。是集药、食、补三大功能为一体的保健果品[1]。由于红枣不耐贮藏，大多以鲜枣销售，加工率较低，其附加值一直不高。据统计，在枣果由白转红的过程中，由于各种自然性灾害天气的影响，常常出现丰产不丰收的现象，仅收枣季节阴雨连绵就造成烂枣率高达20%～40%[2]。鉴于红枣易腐烂霉变，保鲜难度大的特点，红枣除少量鲜用外，大部分在短期内制成干品。目前，我国红枣种植户和加工企业主要采用自然干制、热风干制和微波干制等方法，其中大部分红枣仍采用自然晾晒，由于红枣果皮往往覆盖一层蜡质，这赋予了干枣产品特有的品质，使其表皮光亮、美观，极大提高其商品价格和市场竞争力。然而往往因为红枣果皮覆盖的这一层致密蜡质层，会明显阻碍果实内部水分的蒸发[2]，使干燥时间延长，大量鲜果因干燥时间过长而霉变腐烂，造成浪费。

植物表皮蜡质组成成分复杂，物种不同蜡质的组成成分也不同，蜡质主要是由碳原子数在20～34碳之间的特长链脂肪酸及其衍生物（包括烷烃、醇、醛、脂肪酸和酯等）组成，还包括萜类和其他微量次级代谢物如固醇和类黄酮类物质[3]。为客观揭示南疆灰枣果皮蜡质成分，本课题拟采用溶剂萃取法对红枣表皮蜡质进行提取，并通过气相色谱－质谱联用法（GC－MS）对南疆灰枣果皮蜡质粗提物进行初步分析，以探索灰枣果皮蜡质组成，为生产加工中红枣果皮蜡质的保护或脱除提供参考，为红枣保鲜和干制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

南疆灰枣：2011年9月采摘自塔水处水工二连，九成熟。

1.1.2 仪器

752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SHZ－D循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；BS210S电子天平：北京赛多利斯仪器公司；Trace－DSQ气相色谱－质谱联用仪：美国热电公司，等。

1.1.3 试剂

三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、重铬酸钾、吡啶、N，O－双（三甲基硅烷基）、三氯乙酰胺（BSTFA）等，所有试剂均为分析纯。

1.2 蜡质提取工艺

1.2.1 工艺流程

原料选择→原料处理→溶剂提取→抽真空干燥→蜡质粗提物

1.2.2 工艺要点

原料选择及预处理：选择大小均匀，成熟度一致，无裂痕无病虫害和无机械损伤，品质优良的枣。灰枣采摘后，立即放入4℃冷库中保鲜，取一部分枣洗净晾干，装入保鲜袋放入冰箱中待用。

溶剂提取：将处理过的枣放置在一定提取溶液的烧杯中，轻微搅拌并保持一定的时间，注意这个过程中不可破坏枣的表皮，此操作需在通风橱内操作。

抽真空干燥：将提取后的溶液在密闭容器中进行抽真空干燥，除去三氯甲烷等提取溶剂，此操作在通风橱内进行。

蜡质粗提物：有机溶剂挥发完全后，用恒重法再次称量烧杯，直至质量保持恒定，再用差量法求得提取的蜡质质量。

1.3 方法

1.3.1 蜡质成分定性分析[4]

由于蜡质与重铬酸钾反应会产生颜色变化，而分光光度计能检测出这种变化，所以选用分光光度计对蜡质成分进行定性检测。检测方法如下：将40 mL去离子水和20 g粉末状的重铬酸钾混合，再加入1L的浓硫酸（用量可根据比例调整），加热直到溶液无悬浮颗粒及沉淀为止。在每个烧杯（含抽干后的蜡质）中加入5 mL重铬酸钾溶液，冷却后，加入12 mL去离子水，等待10 min让其反应。然后用分光光度计在590 nm的波长下下进行光密度分析，确定蜡质成分的含量。

1.3.2 GC－MS分析蜡质成分

1.3.2.1 样品预处理

在GC－FID和GC－MS分析之前，羟基和羧基要通过和N－O双三甲基硅基三氟乙酰胺在吡啶条件下（30 min，70℃）反应，被转换成相应的三甲基硅烷基衍生物。

1.3.2.2 分析条件

分析前将蜡质溶于三氯甲烷，使蜡质浓度为10 mg/mL。本实验采用DB－5毛细管色谱柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm。实验参考王美芳等[5]的方法并改进，具体条件如下：色谱条件：起始柱温50℃，保持1 min，以20℃/min升温至170℃保持2 min，以5℃/min升至300℃保持8 min，载气为He，流速1.2 mL/min分流比1∶10，进样口温度280℃，传输线温度280℃；质谱条件：离子源温度230℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描范围 50 amu～650 amu。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂确定

本实验根据Shu－Jun Xu[6]和王美芳[5]的研究，选择三氯甲烷，二氯甲烷，正己烷做为提取溶剂，提取时间为20 s，溶剂添加量为20 mL，以确定蜡质提取的最佳溶剂，结果如图1所示。

由图1可知，在相同条件下，不同溶剂提取量不同，其中提取量最大的是二氯甲烷为43.2 mg/100 g，最小的是正己烷4.0 mg/100 g，因此，本实验确定二氯甲烷为最佳提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对蜡质提取量的影响Fig.1 The effect of different extraction solvents on the extraction of jujube epicuticular wax

2.2 溶剂添加量确定

根据周小云等人[7]的研究，以三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷为提取溶剂，在提取时间为20 s时，选取溶剂添加量分别为 15、20、25、30、35 mL，以确定蜡质提取的最佳溶剂用量，结果如图2所示。

图2 溶剂添加量对蜡质提取量的影响Fig.2 The effect of different extraction solvents volume on the extraction of jujube epicuticular wax

由图2可知，随着溶剂添加量的增加，蜡质提取量有所增加，当溶剂添加量达到20 mL时，再增加溶剂添加量，蜡质提取量上升效果不明显，所以实验过程中选取20 mL为最佳溶剂用量。

2.3 溶剂混合比例确定

在以上实验的基础上，取提取时间为20 s，提取剂量为20 mL，3种提取溶剂三氯甲烷∶二氯甲烷、三氯甲烷∶正己烷、二氯甲烷∶正己烷，每种分别按照 1∶2、1∶1、2∶1的体积比混合提取蜡质，以期获得最佳溶剂混合比例。

结果表明，三氯甲烷与二氯甲烷混合使用效果最好，可明显增强溶剂的浸提率，混合后的提取量从大到小的比例为：1∶2（53.7 mg/100 g）、1∶1（52.8 mg/100 g）、2∶1（51.0 mg/100 g），三氯甲烷与正己烷混合的提取结果分别为8.5、15.8、28.3 mg/100 g；而二氯甲烷与正己烷混合后提取结果分别为12.3、25.2、33.5 mg/100 g。由此可以看出三氯甲烷与二氯甲烷混合比例为1∶2时提取效果最好。

2.4 提取时间确定

根据郑喜清等[8]的研究选择20 s到60 s作为本实验的提取时间。在溶剂用量20 s、溶剂三氯甲烷：二氯甲烷体积比为1∶2的条件下，分别设置提取时间为20、40、60、80、100 s，最终确定最佳提取时间，结果如图 3所示。

图3 浸提时间对蜡质提取量的影响Fig.3 The effect of different extraction times on the extraction of jujube epicuticular wax

由图3可知随着时间的增加蜡质质量逐渐增加，当提取时间达到60 s时灰枣表皮蜡质基本溶出，再增加时间蜡质提取量上升效果不明显，因此，选择60 s为最佳提取时间。

2.5 最佳提取工艺正交试验

在单因素试验的基础上，选取溶剂添加量（15、20、25 mL）、三氯甲烷与二氯甲烷混合比例（1∶1、1∶2、2∶1）、提取时间（20、40、60 s）三个因素，根据蜡质提取量的大小，选取三个水平建立L9（33）正交表进行正交试验（表1）。

表1 L9（33）正交试验结果Table 1 Results of orthogonal test by L9（33）

由表1可知，时间对提取量的影响最大，其次是溶剂添加量，最后是混合比例。因此，最佳工艺条件为A2B2C3，即溶剂添加量为20 mL，三氯甲烷与二氯甲烷的比为 1∶2，提取时间为 60 s。

2.6 GC-MS分析结果

在以上试验基础上，将所提取蜡质物质通过处理后按照上述气质联用方法和条件进行GC-MS分析，其结果见图4和表3所示。

表2 方差分析结果Table 2 Variance analysis of experimental results

图4 灰枣表皮蜡质成分的总离子流图Fig.4 The better condition of extraction from jujube epicuticular wax components of the total ion chromatogram

表3 灰枣表皮蜡质成分的GC-MS 分析结果Table 3 Compositions of Jujube epicuticular wax by GC-MS

续表3 灰枣表皮蜡质成分的GC-MS分析结果Continue table 3 Compositions of Jujube epicuticular wax by GC-MS

由图4和表3可知，GC-MS共检测到29个峰，经检索Nist05谱库和人工解析谱图相结合，鉴定出24种化合物，占总质量分数的76.17%，其中匹配度较高的组分有6-烯丙基-4甲氧基苯并1，3-二氧环戊烯（37.23%）、十六碳酸（9.56%）、9反-十八碳烯酸（6.82%）、5-亚异丙基-1，3环戊二烯（1.34%）、己酸（1.73%）、甘油（3.98%）、壬酸（1.26%）、9反，12反-9，12十八二碳烯酰氯（0.90%）、10反-十五烯醇（2.23%）、9顺，12顺十八碳二烯酸1-甘油酯（0.93%）。

3 结论

本文通过单因素和正交试验研究了红枣果皮蜡质提取条件，考察了提取溶剂、溶剂添加量、溶剂混合比和提取时间对提取灰枣果皮蜡质成分的影响，实验表明，以三氯甲烷和二氯甲烷为提取溶剂，溶剂添加量为20 mL，三氯甲烷与二氯甲烷混合比为1∶2），提取时间为60 s时其提取效率最好。对所得蜡质经气质联用分析共鉴定出24种化合物，其中酯类5种，酸类7种，醇4类种，烯类3种，烷类2种，三氟乙酰胺、9反，12反-9，12十八二碳烯酰氯各一种。

[1] 闫忠心,鲁周民,刘坤,等.我国红枣资源加工利用研究现状与展望[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2010,38（6）：102-108

[2] 郭福则.红枣加工产品的加工工艺[J].科研推广农产品加工,2004,24（6）：30-31

[3] GREENE P R,BAIN C D.Total internal reflection Raman spectroscopy of barley le-af epicuticular waxes in vivo[J].Colloids surfaces B,2005,45：174-180

[4] Fei Wang A B C,Peng Zhang D,Sheng Qiang A E,et al.Effects of epicuticular wax from Digitaria sanguinalis and Festuca arundinacea on infection by Curvularia eragrostidis J[J].Austra Lasian plant pathology,2008,37:43-52

[5] 王美芳,陈巨莲,程髓发,等.小麦叶片表面蜡质及其与品种抗蚜性的关系[J].应用与环境生物学报,2008,14(3):34-346

[6] Shu-Jun Xu,Ping-An Jiang,Zheng-Wu Wang,et al.Crystal structures and chemical composition of leaf surface wax epositions on the desert moss Syntrichia caninervis[J].Biochemical systematics and ecology,2009,37:723-730

[7] 周小云,陈倌波,徐向丽,等.稻叶表皮蜡质提取方法及含量的比较[J].湖南农业学报,2007,33（3）：273-276

[8] 郑喜清,胡俊,胡宁宝,等.不同哈密瓜品种对细菌性果斑病的抗性与蜡质的关系[J].内蒙古农业大学学报,2007,28（2）：132-134