小分子NEK2干扰RNA对肺癌细胞耐药的研究

陈永锋+王海晶+刘丁瑗+周向东

[摘要] 目的 探讨小分子NEK2干扰RNA（siRNA-NEK2）逆转人肺癌耐药细胞（A549/DDP）耐药性的研究。 方法 应用Real-time PCR法及Western blot法验证NEK2基因在人肺腺癌耐药细胞系（A549/DDP）细胞系呈现高表达；并采用脂质体为转染介质，将NEK2小片段RNA导入A549/DDP细胞沉默NEK2基因；应用MTT法观察顺铂、阿霉素对沉默NEK2基因后的A549/DDP细胞的细胞毒活性变化。 结果 NEK2-mRNA、NEK2蛋白在A549/DDP细胞系表达水平均显著高于A549细胞系，差异有统计学意义（P < 0.05）；顺铂、阿霉素对A549/DDP细胞的半数抑制浓度（IC50）分别是（53.08±0.56）、（8.09±0.31）μg/mL，对siRNA-control A549/DDP细胞的IC50分别是（53.09±0.78）、（8.10±0.98）μg/mL，而对siRNA-NEK2 A549/DDP细胞的IC50有显著下降，其值分别是（18.59±0.10）、（2.30±0.14）μg/mL，两组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 小分子NEK2干扰RNA沉默NEK2可以提高耐药的肺癌细胞对化疗药物的敏感性。NEK2可能成为逆转肺癌耐药的一个新的靶点。

[关键词] 肺癌；细胞耐药；NEK2；siRNA-NEK2

[中图分类号] R563.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）02（b）-0017-04

Study of drug-resistant effect on lung cancer cells with siRNA-NEK2 silencing

CHEN Yongfeng1，2 WANG Haijing1 LIU Dingyuan1 ZHOU Xiangdong1

1.Department of Respiratory， Southwest Hospital of the Third Military Medical University， Chongqing 400038， China； 2.Department of Reception， the 75600 Army Hospital of PLA， Guangdong Province， Shenzhen 518048， China

[Abstract] Objective To investigate the drug-resistant effect of siRNA-NEK2 on lung cancer cells lines A549/DDP. Methods Expression of NEK2-mRNA and NEK2-protein was examined in human A549 cells and A549/DDP cells by Real-time PCR and Western blot. The changes of cytotoxic activity were observed on the A549/DDP cells of silence NEK2 by MTT assay. Results The expression of NEK2-mRNA and NEK2 protein were higher in A549/DDP cells than A549 cells （P < 0.05）. After treatment with DDP and Epirubicin， the IC50 values of A549/DDP cells were （53.08±0.56） and （8.09±0.31） μg/mL respectively， and the IC50 values of siRNA-control A549/DDP cells were （53.09±0.78） and （8.10±0.98） μg/mL respectively. While the IC50 values were significantly decreased in siRNA-NEK2 A549/DDP cells [（18.59±0.10）， （2.30±0.14） μg/mL]， two groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Silence NEK2 with interfering RNA molecule can reduce the resistance of lung cancer cells with resistant and may increase the sensitivity of chemotherapy-resistant lung cancer patients. Therefore， NEK2 may be a new target that reverses the drug resistance of lung cancer.

[Key words] Lung cancer； Drug resistance； NEK2； siRNA-NEK2

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，已成为世界上死亡率第一位的恶性肿瘤。约80%的患者就诊时已属晚期，化疗成为其主要治疗手段，而肺癌耐药现象的产生是影响化疗效果的重要原因。已有研究表明，肿瘤细胞耐药的分子机制极其复杂，除了进入肿瘤细胞内的药物浓度减少外，DNA断裂修复加速、靶基因突变、扩增、以及凋亡抑制蛋白的表达差异等均会导致肿瘤细胞耐药[1]。因此，逆转肺癌耐药的发生，已经成为肺癌治疗研究中的热点。NEK2（NIMA-related kinase 2，NEK2）是一种哺乳动物细胞中的NIMA相关激酶，属于中心体相关蛋白激酶[2]。NEK2及其同系物过表达可以聚集中心体而过快推进有丝分裂进程甚至直接触发染色质的分裂[3]。近年来的研究已发现，NEK2广泛高表达于多种肿瘤，具有调节肿瘤细胞生长的作用[4]；NEK2基因的过表达可显著增强将化疗药物泵出细胞外的蛋白质的活性，导致耐药性的产生[5]。本研究拟从沉默NEK2基因入手，探讨耐药的肺癌细胞沉默NEK2基因后，化疗药物敏感性的变化，为临床肺癌化疗耐药逆转，提高化疗疗效寻找新的靶点和途径。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与细胞系

人肺腺癌敏感细胞系A549细胞和耐顺铂（DDP）人肺腺癌细胞系A549/DDP细胞，均购自第三军医大学新桥医院呼吸病研究所。顺铂、阿霉素（江苏豪森药业有限公司）。CO2细胞培养箱（Binder，德国），激光共聚焦显微镜（Bio-Rad，美国），RNAiso plus kit、PrimeScriptR RT reagent kit、LipofectamineTM RNAiMAX（Invitrogen，美国），ECL化学发光试剂盒（Boehringer Mannheim，德国），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Takara，大连），RPMI-1640培养基、MTT、DMSO、TBST缓冲液、胎牛血清（FCS）（GIBCO BRL，美国）。

1.2 细胞培养

人肺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的改良型RPMI-1640培养基中，并置于37℃、5%CO2、达到饱和湿度培养箱中培养。每2～3天以0.25%的胰蛋白酶进行消化传代。A549/DDP细胞用含10% FBS的RPMI-1640培养液进行复苏，培养2～3 d后待细胞生长状态良好时用半量顺铂培养液（顺铂浓度：0.5 μg/mL）培养1夜，再以全量顺铂培养液（顺铂浓度：1 μg/mL）培养1夜，在37℃、5%CO2条件下培养，每2～3天传代1次。

1.3 RNA的提取与RT-PCR

采用RNAiso plus kit试剂盒提取细胞总RNA，按照试剂盒要求操作。NEK2上游引物序列：5'-CCACAGACGAAGTGATGGTG-3'，下游引物序列：5'-TGATTTTCCCAGCGAGTTCT-3'，检测按实验室常规方法进行PCR扩增。定量PCR采用的体系为：dNTPs 2 μL，10×buffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μL，模板2 μL，加三蒸水至总体积50 μL；扩增条件为：预变性94℃ 5 min，进入循环，变性94℃ 1 min，退火60℃ 1 min，延伸72℃ 3 min，30个循环后，72℃延伸5 min。以β-actin为内参，依据2-ΔΔCT法计算各组细胞mRNA的相对表达量。

1.4 Western blot法

将培养的细胞用0.05%胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后离心弃上清，加入含全酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液冰浴裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶，冰浴进行电泳，电泳分离后用半干转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加抗人NEK2多克隆抗体4℃孵育过夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶标记的二抗室温孵育2 h。洗膜后ECL发光，X线片显影、定影、扫描仪扫描胶片。

1.5 NEK2基因siRNA序列的设计及转染

siRNA片段由上海生工合成。靶向NEK2的siRNA序列为5'-CCAAGGAAAGGCAAUACUUUUdTdT-3'（sense）和5'-AAGUAUUGCCUUUCCUUGGUUdTdT-3'（antisense）。制备终浓度为80 nmol/L的siRNA-脂质体复合物，实验组加入siRNA-NEK2混合物，同时设置空白对照组。将人耐药肺腺癌细胞A549/DDP以2×105个/孔接种于6孔板，待细胞生长至70%～80%时，更换无血清培养基，采用LipofetamineTM 2000将siRNA-NEK2转染细胞。

1.6 噻唑蓝（MTT）法检测顺铂对沉默NEK2后A549/DDP细胞增殖活性的影响

取对数生长期细胞接种于96孔板，实验分为4组即：A549细胞组（记为A549组）、A549/DDP组、A549/DDP转染Silencer Negative Control siRNA组（记为siRNA-Control A549/DDP组）及A549/DDP转染siRNA-NEK2组（记为siRNA-NEK2 A549/DDP组）。细胞贴壁后，弃去旧培养基，加入终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的含药培养基200 μL，每组浓度设6个复孔，同时设不含细胞仅有培养基的空白组和含细胞不加药物的阴性对照组。加药完毕放入培养箱孵育24 h。取出培养板，每孔加20 μL MTT，放入培养箱中继续孵育4 h。小心吸弃上清，每孔加入150 μLDMSO，震荡10 min使紫色结晶充分溶解，酶标仪于490 nm处测定各孔A值，记录结果。计算各给药浓度的抑制率，用SPSS 16.0求各药物的半数抑制浓度（IC50）值。细胞增殖抑制率（%）=[1-（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）]×100%。

1.7 统计学方法

所得数据用SPSS 16.0软件进行统计学分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计量资料采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NEK2在A549细胞与A549/DDP细胞系中的表达

采用RT-PCR方法分析比较NEK2-mRNA在A549细胞和A549/DDP细胞系的表达水平，结果如图1A显示，NEK2-mRNA在A549/DDP细胞系中的表达水平明显高于A549细胞系。证明NEK2-mRNA在人耐药非小细胞肺癌A549/DDP细胞系中呈现出高表达，提示肺癌耐药性与NEK2的表达差异性有关。采用Western blotting方法比较NEK2蛋白在A549细胞及A549/DDP的差异表达。结果如图1B所示，NEK2蛋白在A549/DDP中的表达水平明显高于A549细胞，与基因水平结果一致，提示NEK2蛋白高表达与肺癌细胞的耐药有关。

与A549比较，*P < 0.05

图1 NEK2在A549及A549/DDP细胞中的表达水平

2.2 siRNA-NEK2沉默效果鉴定

采用RT-PCR及Western blot检测siRNA-NEK2转染A549/DDP细胞后的沉默效果。siRNA-NEK2转染A549/DDP细胞24、48 h后，与对照组相比，NEK2 mNRA及蛋白表达水平均下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

与对照组比较，*P < 0.05

图2 siRNA-NEK2转染效果图

2.3 顺铂及阿霉素对沉默NEK2后A549/DDP细胞增殖活性的影响

采用脂质体为转染介质，将NEK2小片段RNA导入A549/DDP细胞沉默NEK2基因，并用MTT法检测顺铂及阿霉素对A549以及沉默NEK2前后A549/DDP细胞的增殖抑制活性。沉默NEK2基因后，顺铂及阿霉素对siRNA-NEK2 A549/DDP组的增殖抑制活性较A549/DDP组、siRNA-control A549/DDP组明显增加，IC50明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。说明沉默NEK2可以增加化疗药物对肺癌细胞的敏感性。见图3、表1。

图3 顺铂及阿霉素对细胞的增殖抑制曲线

表1 顺铂及阿霉素对细胞半数抑制浓度影响（μg/mL，x±s）

注：与siRNA-NEK2 A549/DDP组比较，*P < 0.05

3 讨论

肿瘤细胞产生耐药性是化疗药物在临床应用时的常见阻碍，它会导致化疗的失败，与患者治疗效果不佳有关，包括癌症的复发和患者的死亡[6]。因此，研究耐药性的产生机制并寻找应对方法，是提高化疗药物临床有效性的迫切需要。NEK2属于丝氨酸-苏氨酸激酶，集中于染色体着丝，粒通过底物磷酸化调节纺锤体的形成和分离，影响细胞有丝分裂从而调节细胞的增殖[7]。研究发现，NEK2基因与增加癌症抗药性、加速癌症生长以及患者死亡率上升存在很强的相关性。在2500例患者中，NEK2基因表达的增加均与患者的快速死亡有关[5]。对乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞耐药机制的研究中发现，NEK2干扰siRNA可以改善癌细胞对化疗药物的敏感性[8]。本研究经RT-PCR法及Western blot法证明了耐药的肺癌细胞A549/DDP细胞NEK2-mRNA、NEK2蛋白表达水平显著高于A549细胞，说明NEK2与肺癌细胞耐药有关。

前期研究发现耐药的肺癌细胞系A549高表达NEK2，本研究采用siRNA抑制细胞表达NEK2，观察肿瘤细胞的生长变化。研究通过MTT法发现抑制NEK2表达后，细胞增殖能力明显受到抑制，推测与NEK2的微管调控作用相关。

研究发现，NEK2与肿瘤细胞中染色质不稳定性相关[9]。在细胞有丝分裂过程中，染色质的分离是一个依赖于微管活动的复杂过程，微管形成纺锤体后，引起细胞分裂。NEK2在中心体的定位依赖于其C端调节区域内的有丝分裂，此定位也是微管结合所必需的[10]。抑制NEK2能阻碍中心体的成熟和纺锤体相关蛋白的招募[11]；所以总的来说，NEK2不仅是中心体分裂间期一个关键的组件，而且还是中心体自身装配及检修所必需的。研究表明，沉默NEK2后，TNBC细胞对阿霉素的敏感性增加，并且使TNBC细胞凋亡增加，可能是由于有丝分裂的异常[12]。

本研究通过小分子NEK2干扰RNA，并经MTT法观察顺铂、阿霉素对沉默NEK2后A549/DDP细胞增殖抑制活性的影响，结果发现顺铂及阿霉素对siRNA-NEK2 A549/DDP细胞的增殖抑制活性与对照组（A549/DDP、siRNA-control A549/DDP）相比明显增加，IC50明显下降，细胞凋亡率明显增加，说明沉默NEK2可以提高耐药肺癌细胞A549/DDP对相关化疗药物的敏感性，使得肺癌细胞耐药得到逆转。本实验结果表明，非小细胞肺癌的耐药性和抗凋亡因子NEK2的表达上调密切相关；小分子NEK2干扰RNA沉默NEK2基因能够提高耐药肺癌细胞对相关化疗药物的敏感性，肺癌细胞耐药得以逆转；NEK2可以成为逆转肺癌细胞耐药的一个新靶点。

[参考文献]

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（收稿日期：2013-09-06 本文编辑：李继翔）

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（收稿日期：2013-09-06 本文编辑：李继翔）

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（收稿日期：2013-09-06 本文编辑：李继翔）