基于人工神经网络的碱性蛋白酶水解乳清蛋白预测模型的建立

苏玉玲，刘雯，田波，*，冯志彪

（1、东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2、东北农业大学理学院，黑龙江哈尔滨 150030）

乳清蛋白营养价值极高，是国际上公认的人体最优质蛋白质补充剂之一[1]。其不仅容易消化，且具有较高的生物活性。大量研究表明，通过酶解乳清蛋白，不仅可以改善其功能特性，且在水解过程中能释放许多有着特殊生物活性的肽段。因此，有目的地控制乳清蛋白的水解进程，可获得不同分子量的小肽，对于开拓乳清蛋白的应用具有重要意义[2]。

蛋白质的水解度（Degree of hydrolysis, DH）是衡量蛋白质水解程度的一个重要指标[3]和重要性状参数，用于评价蛋白肽腱的断裂的情况以及肽的平均分子量的变换。蛋白的水解程度与蛋白功能特性的改善或是释放出某种生理功能的生物活性肽有很大关系。在实际应用过程中所有的水解并非要达到最大的水解度最有益，有限水解对改善含蛋白质体系质构特征的加工艺技术的研究有着较大的实用意 义。张雅丽[3]等人对大豆蛋白芝麻蛋白的合成类蛋白质研究中指出最佳的底物为水解度为 80%水解物，并非最大的水解度 90%的水解物。刘佳[4]也在大豆蛋白ACE抑制肽的研究中得出：水解度与ACE抑制活性之间存在一定的对应关系，水解度的较低和较高都会降低ACE的抑制活性。彭新颜[5]也指出，并不是水解度越大，所得产物的抗氧化效果越好，而是只有在特定的水解度下，水解物具有最大的抗氧化能力。因此，为了优化操作，缩短试验时间，便于试验条件选择，需要对有限水解过程进行模型化研究。

神经网络（Artificial neural networks，ANNs），是一种仿效脑的神经网络行为特征的数据分析方法。神经网络以神经元阵列来模拟生物体学习和记忆的方式，通过改变网络的突触链接点的连接关系对信息进行编码。ANNs应用于一个实际问题通常需要五个步骤，在每个步骤中，研究者必须要选择适当的网络参数[6,7]。每个步骤的选择都基于经验以及现存的指导准则和应用实例。第一步，对于网络拓扑结构和每层的神经元数量的选择[8,9]。第二步，为隐藏的神经元选择变换算符[6]。第三步是初始分配的权重。第四步是训练过程，最常见的训练技术是反向传播技术。最后，是利用未被用于训练的数据（测试集）检验所建立的神经网络的效果。测试结果也可以预测网络运行过程和监测系统的效力[7]。

ANNs的特点不仅可以处理嘈杂、不完整的数据和非线性问题，也可以在训练过程之后立即进行预测和归纳[8]。即使反应的机理不明确这种技术仍可以准确预测[10,11]；ANNs优于其他模型之处还在于可以一边辨识网络构造参数，一边学习和适应样本。在食品科学研究中，ANNs用于估计预测食品性质和加工中相关的因素，例如葡萄糖淀粉酶对淀粉的水解模型，酶失活的动力学模型，利用视觉技术及气味分辨技术评价食品质量、品质等[12-14]。本实验的研究目标是建立碱性蛋白酶促乳清分离蛋白水解的ANNs预测模型。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

Alcalase碱性蛋白酶 丹麦NOVO公司；乳清分离蛋白WPI 美国HILMAR公司。

PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂；磁力加热搅拌器 杭州仪表电机厂。

1.2 乳清蛋白的水解

称取一定量的乳清蛋白，加入蒸馏水中，搅拌均匀，80℃加热10min，作为储备液。储备液在恒温磁力水浴锅50℃水浴，加酸(HCl)或碱(NaOH)达到预定的pH值，加入试验设计量的 Alcalase酶进行水解，水解时间为试验设计的时间。水解过程保持不断地搅拌，加入NaOH以维持pH值的变化在规定范围的±0.05内，达到预定时间后，加入2mol·L-1HCl调节pH值至4.0，使未水解的蛋白沉淀下来，100℃水浴15min对酶进行灭活，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r·min-1离心20min，分离出上清液[15]。

1.3 水解度的测定

水解过程中通过从滴定管中连续的添加少量1mol·L-1NaOH保持pH为试验设定值。添加量如下：第一次是水解5min后，随后在120min内每次间隔10min，120min后每次间隔20min。水解度计算公式为[16]:

式中，B为NaOH用量（mL）；

NB是NaOH的标定浓度（mol·L-1）；

α是α-氨基基团的平均离解度；

MP是水解蛋白的质量（g）；

htot是蛋白质总肽键数.

1.4 正交试验

正交表L25(56)设计试验，取四个主要因素pH值、酶用量、底物浓度、水解时间，每个因素设为五个水平，设一个误差列考察试验误差，列出影响因素与水平表1，每个试验重复三次。用Excel对正交试验结果进行分析。

表1 L25(56)的影响因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 人工神经网络模拟

在正交试验的基础上，对正交试验所得到的的25组数据和验证组7组数据，总计32组数据，使用Matlab的nnet工具包中的nftool建一个神经模型。实验相关参数设定如下：一般属性为 4个， 分别是乳清蛋白水解的pH值、酶用量、底物浓度、水解时间, 目标属性是水解度(DH/%)；将数据集随机的分为三组：训练集、测试集和验证集（80%，10%，10%）；在训练过程中设定隐含层节点数为15。由于nftool包的初始值为随机值，因此每次拟合的效果有一定的随机性，因此需要多拟合几次，从中选择效果较好的拟合曲线作为训练出的网络。

2 结果与讨论

2.1 水解度的正交结果

根据表 1 的因素和水平进行正交实验设计，按照设计的实验点进行实验，测得各因素水平组合下的水解度（DH），结果见表 2，结果进行3 次重复。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 神经网络的结构及参数选择

预测乳清蛋白水解过程，采用拟动力神经网络，见图1。为了提高网络模型性能，选用两步反向结构，这种结构被用于神经网络已经有很长的历史了。本实验设置了15个隐藏神经元，选用Levenberg-Marquardt训练算法（8个训练元；训练过程从随机初始权重值开始，并被重复 100次，以获得最佳的解决方案）[17]，采用随机分配的权重值，本实验数据库中包含32个数据用于神经网络模型训练。

图1 人工神经网络的通用结构Fig.1 The general structure of applied neural model

2.3 乳清蛋白水解神经网络拟合结果分析

误差直方图如图2所示，纵坐标代表样本点个数，横坐标代表误差区间。各样本点与零误差线之间差距代表样本点与预测值之间的误差。可见绝大多数样本点分布在零误差线的区间内。而由测试集的分布可知，首先，测试集样本点在零误差线左右都有分布，说明误差分布均匀；再次，测试集有四个点分布在（±1.000）的范围内。说明测试集中的样本点与预测所得输出值之间误差较小，说明预测效果良好，数据基本分布在拟合的曲线附近。

图2 误差分布直方图Fig.2 Error Histogram

人工神经网络训练乳清蛋白水解模型其拟合回归系数R-value，表现输出数据与目标数据之间的相关状况。图3可知，Training、Test与All图中R-value分别为0.98536、0.96239和0.97995，图中实线为拟合效果曲线，与R-value =1的标准曲线基本吻合，斜率接近45°，测试点和样品点均匀的分布在拟合曲线附近，因此说明此模型具有较好的训练效果、预测能力和整体拟合效果。Validation图中R=1，说明当前设置的参数下，拟合结果随机验证效果优良。对于训练数据，不仅相关系数据在0.9600～0.9999范围内，而且该模型是在实验数据的基础上得到的，总是包含噪声，例如测量误差等。因此我们可以认为本实验所建立的人工神经网络的水解模型能够准确地预测实验结果。

图3 拟合回归及验证测试图Fig.3 Plotregression and verification figure

2.4 预测结果对比

训练好的网络经过验证可以判定其效果，5组数据的预测结果见表3。

表3 预测结果对比表Table 3 Comparison of prediction results to target

由表3可得，输入的5组测试样品与网络输出值之间的最大误差不超过3%，说明神经网络预测模型具有较高的预测能力和精度，模型可用于对水解程度的预测，对碱性蛋白酶有限水解乳清蛋白具有指导意义。

3 结论

本实验在正交试验所得数据的基础上，选用3层人工神经网络，设置了15个隐藏神经元，选用ANN神经网络方法建立了水解模型，迭代计算后最终整体R-value=0.97995，结果表明该神经网络拟合效果很好，而对于测试集合的 R-value=0.96239，表明该水解模型有很好的预测能力，能够完成实验结果的预测。选用的测试组的实验结果与神经网络输出值之间的误差均在±3%以内，说明其具有良好的预测能力。从以上结果可知，在有限水解范围内，神经网络预测模型能够很好的预测水解程度，可以用此模型进一步研究的蛋白功能特性和多肽的生理生物活性物质，并且更利于水解条件的选择，还可以缩短必要的工艺时间。

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