化学发光分析法测定沙拉沙星的研究

蒋清民，张可擎，王军

(1.河南化工职业学院应用化学系，河南郑州 450042;2.陕西省石油化工研究设计院质检中心，陕西西安 710054)

沙拉沙星(Sarafloxacin)是继恩诺沙星之后的又一新的动物专用药，抗菌活性强于双氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星-丁胺卡那霉素及妥布霉素等，对厌氧菌的抗菌活性与环丙沙星相当。沙拉沙星的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)［1］、分子荧光光度法［2］与紫外可见分光光度法［3］等。沙拉沙星分子结构中含有α-酮酸基团，可与Tb3+配位而产生分子内能量转移，发射荧光。据此，王磊等［4］测定了盐酸沙拉沙星注射液中沙拉沙星的含量。研究发现，Tb3+对 Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin化学发光体系有很强的增敏作用，据此建立了流动注射-化学发光法测定沙拉沙星的新方法，此法具有灵敏度高、选择性高等优点。不需任何预处理，适当稀释就可直接测定沙星注射液中沙拉沙星的含量，回收率为95.1% ～101.4%，并与国标方法进行了对照，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

盐酸沙拉沙星注射液;沙拉沙星对照品(河南省药品食品检验鉴定所提供，纯度 ＞99.0%);TbCl3、Ce(NH4)2(NO3)6均为分析纯;实验所用水为石英亚沸重蒸水。

IFFM-D流动注射化学发光仪。

1.2 溶液配制

1.2.1 铽储备液(10 mmol/L)配制 称取3.73 g TbCl3，溶于三次水，定容至100 mL。

1.2.2 Ce4+溶液(10 mmol/L)配制 称取 5.48 g Ce(NH4)2(NO3)6，溶于水，定容至 100 mL。

1.3 实验方法

各溶液流路如图1所示，采用流动注射技术，首先将沙拉沙星标准溶液或样品溶液与H2SO3溶液混合注入进样阀，然后以Ce4+与Tb3+混合液为载流，将样品混合液载入流通池中发生化学发光反应，记录信号，以峰高定量。

图1 流动注射化学发光分析仪流路图Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence analysisV.注射阀;P.泵;C.流通池;PMT.光电倍增管;AMP.放大器;R.记录仪;HV.负高压;W.废液;a.样品溶液;b.H2SO3溶液(0.8 mmol/L);c.Ce4+溶液 (0.1 mmol/L);d.Tb3+溶液(0.7 mmol/L)

2 结果与讨论

2.1 流路参数的选择

沙拉沙星、H2SO3、Tb3+和Ce4+4种溶液的进样方式见图1，流速与管道长度对发光强度影响见图2。

图2 流速和管道长度对发光强度的影响Fig.2 Effect of flow rate and pipe length on chemiluminescence intensity

由图2可知，各溶液的流速均为3.8 mL/min，并且流通反应池与样品混合池之间管道长度为20 cm时，发光体系的信噪比最大。

2.2 酸度条件的影响

Ce4+化学发光体系的反应介质多为酸性介质。本文实验了 HCl、H3PO4、HNO3和 H2SO4等 4种酸对发光强度的影响，结果见图3。

图3 酸浓度对发光强度的影响Fig.3 Effect of acid concentration on chemiluminescence intensity

由图3可知，H2SO4作为反应介质浓度为1.5 mmol/L时发光强度最大，所以，选择反应介质硫酸的浓度为1.5 mmol/L。

2.3 Ce4+及H2SO3溶液浓度的选择

在Tb3+-Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin的化学发光反应体系中，通过Ce4+氧化H2SO3而产生化学发光，其浓度对体系发光强度的影响，见图4。

图4 Ce4+和H2SO3浓度对发光强度的影响Fig.4 Effect of Ce4+and H2SO3concentration on chemiluminescence intensity

由图4可知，当Ce4+和H2SO3两种溶液的浓度分别为0.12 mmol/L和1.0 mmol/L时，体系具有最大的发光强度。

2.4 增敏剂及其浓度的选择

Ce4+-H2SO3发光体系的发光强度很弱，Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin体系的化学发光强度也较弱，可加入增敏剂使发光强度增强。实验了Tb3+、Eu3+、罗丹明B、罗丹明6G、荧光素、二氯代荧光素等对Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin体系发光强度的增敏效果。结果发现，Tb3+效果最好，可使其发光强度增加110倍左右，发光信号随Tb3+溶液浓度的增大而增强，结果见图5。

图5 Tb3+浓度对发光强度的影响Fig.5 Effect of Tb3+concentration on chemiluminescence intensity

由图5可知，当Tb3+溶液浓度为0.85 mmol/L时，发光信号已足够大。因此，本实验选择浓度为0.85 mmol/L 的 Tb3+作 Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin发光体系的增敏剂。

2.5 校准曲线、精密度与检出限

在最佳实验条件下，发光强度与沙拉沙星浓度呈良好的线性关系，其线性范围为1.5×10－8～5.0×10－4g/mL。为了提高测定的精密度与准确度，校准曲线按沙拉沙星的浓度范围进行分段绘制，其基本参数见表1。

图6 沙拉沙星测定线性曲线Fig.6 Linear curve of Sarafloxacin

表1 校准曲线线性范围及回归方程Table 1 Linear range and regression equations of calibration curve

对浓度为2.5×10－5g/mL的沙拉沙星进行11次平行测定，相对标准偏差为2.2%，检出限为8.3 ng/mL。

2.6 干扰实验

实验了沙拉沙星样品中可能共存组分对测定的干扰情况，结果表明，对于浓度为2.5×10－5g/mL的沙拉沙星溶液，以误差不大于 ±5% 为限，K+、Na+没有干扰;1 100 倍的 Zn2+、Ba2+、Ca2+、淀粉、硬脂酸镁，300 倍的 Co2+、Pb2+、Ni2+、Cu2+，对实验无干扰，抗坏血酸等还原性较强的物质干扰测定，与其结构相似的氟喹诺酮类药物，例如司帕沙星、诺氟沙星、芦氟沙星等均有严重干扰。

2.7 回收率及样品测定

取不同批次沙拉沙星注射液各1支，分别准确量取1 mL样品(约相当于沙拉沙星 0.1 g)于1 000 mL容量瓶中，定容。取上述溶液适量于25 mL容量瓶中，加入适量系列浓度对照品溶液，定容，结果见表2。

表2 沙拉沙星注射液含量测定结果Table 2 Determination results of Sarafloxacin in injection

由表2可知，本法测定的回收率在97.6% ～101.2%，符合测定要求，适用于沙拉沙星的测定。

3 结论

利用Tb3+能大大增强Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin体系化学发光的现象，可实现对沙拉沙星的测定。最佳实验条件为:1.5 mmol/L硫酸作为反应介质，Ce4+浓 度 为 0.12 mmol/L，H2SO3浓 度 为1.0 mmol/L，增敏剂 Tb3+浓度为0.85 mmol/L，此时体系发光强度最大，方法检出限为8.3 ng/mL，相对标准偏差为 2.2%，加标回收率为 97.6% ～101.2%，测定选择性较好，但还原性物质如抗坏血酸和结构类似的喹诺酮类药物会对测定带来干扰。因此，对于复杂药物的分析需要与分离效果较好的色谱技术联用，这样才能得到理想的测定结果。

［1］李海迪，杨先乐，胡鲲，等.高效液相色谱法测定中华绒螯蟹主要组织中双氟沙星及其代谢产物沙拉沙星方法［J］.药物分析杂志，2009，29(7):1142-1147.

［2］叶鹿鸣，谢东华.高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中3种氟喹诺酮残留研究［J］.中国卫生检验杂志，2008，18(5):804-806.

［3］傅丽，陈金凤，龙运前，等.胶束增敏荧光法测定盐酸沙拉沙星［J］.分析试验室，2008，27(11):95-97.

［4］陈玉海，赵风利，张彦青，等.铽-沙拉沙星荧光光度法测定沙拉沙星含量［J］.分析试验室，2009，28(6):24-26.