均匀设计法优选通心舒颗粒中药材的提取工艺

刘 弘，王俊杰（解放军第152中心医院，河南 平顶山 467000）

通心舒颗粒是由人参、丹参、赤芍、当归、川芎、黄芪等8味中药组成的临床验方，具活血化瘀、行气止痛之功效，临床主要用于治疗瘀血内停所致的胸痹心痛、胸闷刺痛等胸痹症，疗效显著，不良反应少。为制定科学、合理的提取工艺，笔者根据处方中药物的药理作用及有效成分的理化性质，结合中医配伍原则及临床用药特点，采用均匀设计安排试验，以丹酚酸B、芍药苷为指标成分，运用SPSS统计软件处理试验数据，优选通心舒颗粒水提工艺，为实际生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20 AT高效液相色谱（HPLC）仪，包括LC-20 ATvp溶剂输送泵、SCIENCE AT-330柱温箱、SIL-20 A自动进样器、SPD-M20 A二极管阵列检测器、LC solution色谱工作站（日本岛津公司）。

1.2 药材与试剂

处方中各药材由解放军第152中心医院中药房提供，经解放军第152中心医院赵国景副主任中药师鉴定为真品；丹酚酸B、芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为111562-200706、110753-200413）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B、芍药苷的含量测定

2.1.1 色谱条件[1-4]色谱柱:WondasilTM C18（150mm×4.6mm，5µm），流动相:乙腈-0.1%磷酸盐缓冲液（梯度洗脱程序见表1）；流速:0.8ml/min；柱温:30Ⅸ；检测波长:286（丹酚酸B）、230（芍药苷）nm；进样量:10μl。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 称取丹酚酸B、芍药苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为215、208μg/ml的混合对照品溶液。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution

2.1.3 供试品溶液的制备 精密吸取各提取液10ml，置25ml量瓶中，甲醇定容，摇匀，用0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密量取丹酚酸B、芍药苷混合对照品溶液2、6、10、14、15、20、25μl，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积积分值。以对照品进样量（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得丹酚酸B、芍药苷的回归方程分别为y＝1476174.7946 x－13688.9872（r＝0.9999）、y＝1506577.2003 x+78568.9644（r＝0.9998）。结果表明，丹酚酸B、芍药苷的进样量分别在0.416～4.160、0.430～5.375μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取丹酚酸B、芍药苷混合对照品溶液适量，按上述色谱条件重复进样测定6次，每次10μg。结果显示，丹酚酸B、芍药苷的RSD分别为1.29%、1.36%（n均为6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液适量，分别在0、2、4、6、8、16、24h进样10μl，按上述色谱条件测定。结果显示，丹酚酸B、芍药苷的RSD分别为1.72%、1.16%（n均为7），表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批提取液适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定6次，每次10µl，测定丹酚酸B、芍药苷峰面积。结果，丹酚酸B、芍药苷的RSD分别为0.83%、0.96%（n均为6），表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知丹酚酸B（3.2mg/g）、芍药苷（1.3mg/g）含量的通心舒颗粒样品1.5 g，共9份，精密加入样品中各成分质量分数为80%、100%、120%的丹酚酸B、芍药苷对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件测定丹酚酸B、芍药苷含量，并计算加样回收率。结果表明，丹酚酸B、芍药苷的平均加样回收率分别为1.28%、0.51%，RSD分别为1.28%、0.51%（n均为9）。

2.2 均匀设计优选提取工艺

2.2.1 试验设计 根据实际生产及相关文献[5-6]，结合处方中各药味的理化性质，先取处方量人参、丹参进行醇提，将醇提后残渣与方中剩余处方量药材混合，以加水倍数（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，前3个因素拟定为7个水平，提取次数拟定为3个水平；以丹酚酸B、芍药苷转移率（转移率＝提取液中指标成分含量/药材中指标成分含量×100%，1 g丹参中含丹酚酸B的量为56.5mg，1 g赤芍中含芍药苷的量为22.0mg）和干膏得率（干膏得率＝干膏质量/干膏中所含药材质量×100%）为评价指标，选择均匀设计U7（73×3）表进行试验。因素与水平见表2；均匀设计试验结果见表3。

表2 因素与水平Tab 2 Factors and levels

表3 均匀设计试验结果Tab 3 Results of uniform design

2.2.2 数据处理及结果优化[7-9]中药制剂成分复杂，对工艺的评价一般借助于试验数据的优化处理。笔者采用层次分析加权法（AHP）优化试验数据，通过分析处方配伍理论，根据“君臣佐使”原则，明确指标成分权重系数，计算初始权重系数并对其进行一致性检验（CR）。指标成分权重系数分配见表4。

表4 指标成分权重系数分配Tab 4 Distribution of weight coefficient of the components

根据表4安排，对各试验结果计算综合得分率，结果1～7号试验的综合得分率分别为76.58%、80.21%、61.57%、76.96%、42.55%、45.95%、91.75%。采用SPSS17.0统计软件对上述试验结果进行回归分析，以各影响因素为自变量，以指标成分综合得分为因变量，得回归方程为Y＝－4.383+2.516 A－0.085 B+0.098 C+19.791 D，复相关系数R＝0.979，F＝11.639，P＜0.05，表明方程具有统计学意义。由方程可知，加水倍数、提取时间、提取次数与提取效果呈正相关，浸泡时间与提取效果呈负相关，且影响大小为提取次数＞加水倍数＞提取时间＞浸泡时间。结合各试验水平下综合得分结果，虽处方7得分最高，但考虑到实际生产条件及经济性，最终确定最佳提取工艺为加9倍量的水，浸泡20min，提取3次，每次105min。

2.3 工艺验证试验

取人参、丹参醇提后残渣与方中剩余处方量药材混合，采用上述优选的工艺制备供试品溶液，再按“2.1”项下方法测定丹酚酸B、芍药苷含量，计算干膏得率和各指标成分的转移率。结果，各评价指标与正交试验最高值相当，表明优选的工艺重复性好，稳定、可行。工艺验证试验结果见表5。

表5 工艺验证试验结果Tab 5 Results of validation test of technology

3 讨论

中药复方制剂成分复杂，在工艺筛选中选取单一成分作为指标，难免出现片面性。中医药理论指导下的中药制剂，疗效的发挥是多种有效成分共同作用的结果。因此，多指标共同考察工艺参数，不仅能反映制剂的工艺水平，且能在一定程度上反映所用药材的质量，同时指标成分的分离测定还可以综合反映传统中药组方的配伍状况，这既考虑到中医临床用药的习惯，又符合质量控制的要求。

均匀设计在中药制剂工艺优选研究中应用广泛，各试验具备在试验点范围内充分的均匀分散的特点。因此，应保证试验条件的可比性，准确选择考察因素，恰当地确定各因素的考查范围，合理划分因素水平，同一因素各水平之间的差距应足够大，水平之间的差距对评价指标的影响越显著，回归分析结果的精确性就越高；同时应该严格控制试验误差，均匀设计的结果才准确、可靠。本试验在查阅相关文献并结合实际生产的情况下，选取对提取效率影响较大的加水量、浸泡时间、提取时间及提取次数为因素，合理选择各因素水平，通过优化分析，最终得出经济、简便、合理、实用的提取工艺。

采用AHP优化试验数据，较其他方法更为科学、合理的解决综合评价中权重系数选择问题，但在层次分析时应注意一些不足和弊端:指标不能一味增大；AHP仅限于评价指标在9个之内；各指标的权重数值大小需结合专业知识及研究目的来确定，且需要进一步进行CR。SPSS统计软件回归分析结果可以很好地预测及确定最佳工艺水平，验证试验结果表明，选取的各参数准确、可靠。

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