芪归糖痛宁颗粒的UPLC指纹图谱研究Δ

吴健，高家荣，韩燕全，李颖（1.安徽中医药大学药学院，合肥 3003；.安徽中医药大学第一附属医院，合肥 30031）

芪归糖痛宁颗粒为安徽中医药大学第一附属医院国家中医临床研究基地（糖尿病）特色医院制剂，处方由黄芪、当归、生地黄、葛根、延胡索、鸡血藤、威灵仙等七味中药组成，具有益气活血、化瘀通痹之功效，临床用于治疗糖尿病周围神经病变[1-2]。中药复方制剂成分复杂，其质量随原药材产地、来源、种植方法、采收季节、炮制及贮藏条件等不同而差异很大[3-5]。中药的整体作用特点决定了它不同于西药，中药的质量控制方法须对起效的全成分进行控制[6-7]。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制的主要模式之一[8]。为系统、完整地反映芪归糖痛宁颗粒的内在质量，本研究采用超高效液相色谱（UPLC）法建立了其指纹图谱，以达到控制制剂质量、保证用药安全有效的目的。

1 材料

1.1 仪器

Acquity H-Class型UPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 2工作站（美国Waters公司）；KQ3200 DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；BP211 D型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

芪归糖痛宁颗粒（安徽中医药大学第一附属医院制剂中心，批号:20110711、20110924、20111129、20120106、20120301、20120430、20120611、20120824、20121016、20130109）；葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号:110752-200511）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；微孔滤膜（0.22 μm，上海陆纳生物科技有限公司）；水为蒸馏水，磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Acquity BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱温:26Ⅱ；流动相:乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速:0.25ml/min；检测波长:254nm；进样量:1.0μl。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution condition

2.2 对照品溶液的制备

精密称取葛根素对照品2.80mg，置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取10批次芪归糖痛宁颗粒各适量，研细，取0.5 g置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声处理（功率:100 W，频率:40 kHz）20min，放冷，再用甲醇定容，摇匀，取上清液，滤过，即为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取批号为20110711的供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.53%，相对峰面积的RSD为0.10%～1.17%，表明本方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.4.2 稳定性试验 取批号为20110711的供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、16、24h进样测定，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.07%～0.88%，相对峰面积的RSD为0.08%～2.74%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取批号为20110711的芪归糖痛宁颗粒适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.35%，相对峰面积的RSD为0.23%～2.71%，表明本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的构建与评价

2.5.1 指纹图谱的获得 取10批芪归糖痛宁颗粒各适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。10批芪归糖痛宁颗粒的UPLC指纹图谱见图1。

图110 批芪归糖痛宁颗粒的UPLC指纹图谱Fig 1 UPLC fingerprint of 10batches of Qiguitang tongning granules

2.5.2 参照峰的选择 在保留时间为8.60min附近的色谱峰峰面积最大、出峰时间适中且稳定，经与对照品对照认定为葛根素的吸收峰，因此选择其为参照物。色谱见图2。

2.5.3 相似度评价 将10批样品的色谱峰导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）中进行数据处理，各色谱峰进行自动匹配后共获得13个共有峰；以最大共有峰（9号峰）为参照峰（S），将各色谱峰保留时间和峰面积与同一图谱中参照物的保留时间和峰面积进行比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表2、表3。以色谱峰的平均值建立对照指纹图谱[9]，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，均＞0.99，结果见表4。

图2 超高效液相色谱图S1.葛根素对照品；S2.芪归糖痛宁颗粒Fig 2 UPLC chromatogramsS1.puerarin control；S2.Qiguitang tongning granules

表2 不同批次芪归糖痛宁颗粒的相对保留时间Tab 2 The relative retention time of different batches of Qiguitang tongning granules

表3 不同批次芪归糖痛宁颗粒的相对峰面积Tab 3 The relative peak area of different batches of Qiguitang tongning granules

表4 10批样品的相似度评价结果Tab 4 Results of similarity evaluation of 10batches of sample

3 讨论

3.1 提取条件的选择

本研究比较了加热回流与超声两种样品提取方法，结果发现两者没有明显差异，但超声提取法操作更简单、快捷且溶剂损耗少，故选取超声提取法作为本研究的提取方法。本研究也比较了不同提取溶剂的提取效果，分别采用70%甲醇、80%甲醇、甲醇作为提取溶剂，结果发现经甲醇提取后的溶液杂质较少且澄清，色谱图峰形好、基线平稳，故选取甲醇为提取溶剂。

3.2 色谱条件的选择

在色谱柱选择的过程中，笔者比较了Acquity BEH C18（100mm×2.1mm，1.7 μm）、Acquity BEH C18（50mm×2.1mm，1.7 μm）和Acquity HSS T3（50mm×2.1mm，1.8 μm）3种色谱柱及柱温、流速等条件，经优化得到本研究的色谱条件。

在选择检测波长时，笔者分别对黄芪甲苷、梓醇、阿魏酸、葛根素、延胡索乙素和齐墩果酸对照品的检测波长进行综合验证比较，由于黄芪甲苷在紫外区（200～400nm波长处）无吸收；梓醇和延胡索乙素虽在紫外区有吸收，但在此波段下存在的吸收峰较少；齐墩果酸在紫外区存在末端吸收；阿魏酸分离效果不理想；而葛根素在紫外区不仅有吸收，而且通过对样品进行全波长扫描，发现其在254nm波长处存在的吸收峰最多、检测的图谱信息量较多、峰形较好，且各色谱峰的分离度较好、基线较平稳，故选择254nm作为检测波长。

在流动相的选择中，笔者分别考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.5%甲酸水溶液4个流动相系统的梯度洗脱条件，最终发现以乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相系统时各峰的分离度较好，且基线平稳，有利于特征峰的分析，故选其作为流动相。

本研究在色谱条件的优化过程中，确定了在25min内能把供试品溶液的各种物质洗脱完毕；然后不断地改变流动相（乙腈-0.05%磷酸水溶液）比例以调节其极性的大小，达到使溶液中的物质被一一洗脱分离的目的，并且在该检测波长下，基线较平稳、峰形与分离度较好，最终确定了本研究的梯度洗脱条件。

3.3 小结

本研究建立了芪归糖痛宁颗粒的UPLC指纹图谱，经方法学考察，精密度、稳定性和重复性试验结果相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，符合指纹图谱技术要求。并且，对10批芪归糖痛宁颗粒样品进行的相似度评价结果显示，其相似度均在0.99以上，也符合指纹图谱技术要求。综上，所建指纹图谱可用于芪归糖痛宁颗粒的质量控制。

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