PA感染与定植中细胞因子变化的研究

傅玉琼 冉茂娟 周 伟 熊 彬 湛晓勤*

（四川省泸州医学院附属医院呼吸内科，四川 泸州 646000）

PA感染与定植中细胞因子变化的研究

傅玉琼 冉茂娟 周 伟 熊 彬 湛晓勤*

（四川省泸州医学院附属医院呼吸内科，四川 泸州 646000）

目的 探讨铜绿假单胞菌外毒素（PEA）在铜绿假单胞菌肺部感染及定植表达差异的临床价值。方法 SD大鼠180只，随机分为PA（铜绿假单胞菌）感染模型组，PA咽部定植组及生理盐水对照组。取肺组织HE染色光镜下观察肺部炎症情况。结果 ①细菌培养结果：模型组在接种后肺组织PA菌落数明显升高；定植组咽拭子培养见大量PA生长；定植组及对照组肺组织未见PA菌生长；②模型组血清IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α表达在接种后第3、7、11天均明显高于定植组及对照组（其差异有统计学意义）。结论 血清细胞因子IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α检测有助于对铜绿假单胞菌感染与定植的鉴别诊断。

铜绿假单胞菌外毒素；酶联免疫吸附法

铜绿假单胞菌外毒素A（Paeruginosa ExotoxinA，PEA）是铜绿假单胞菌的主要致病物质，通过抑制细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡，95%以上临床分离PA都会分泌这种毒素[1]，其基因高度保守。本实验通过制作大鼠肺部感染及咽部定植模型并检测血液中PEA 表达量的差异，为临床上铜绿假单胞菌的感染和定植的鉴别提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

①清洁级健康雄性SD大鼠180只，体质量200～250 g。②PA菌株：由本学院检验科提供分离出的标准铜绿假单胞菌株，用分光光度比色法配成2个麦氏单位浓度（6×108cFu/mL）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立：所有动物均事先应用地塞米松抑制免疫3 mg/(kg·d)，皮下注射，每日1次，连用7 d。将180只SD大鼠随机分为三组（每组各60只），即模型组：从气管内注入0.4 mL铜绿假单胞菌混悬液（2个麦氏单位浓度6×108cfu/mL）；对照组：从气管内注入0.4 mL生理盐水；定植组：从鼻腔、咽部滴入相同的菌液浓度0.2 mL[6]。

1.2.2 取材：分别于接种后第3、7、11天取材，经腹腔注射2%苯巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，心脏采血方法处死，无菌取出肺组织。

1.2.3 组织病理学检查：取出右侧肺组织，10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片HE染色，光学下观察。

1.2.4 IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α的测定：抗凝血离心后取上清液，收集标本齐后，用ELISA试剂盒检测。

1.2.5 统计学方法：本次研究所有患者的临床资料均采用SPSS15.0统计学软件分析，计量资料采用均数加减标准差表示（），计量资料用t检验，计数资料用χ2检验，组间对比采用χ2检验，P＜0.05为差异有显著性，有统计学意义。

2 结 果

2.1 细菌培养结果

肺组织细菌培养结果主要如下：模型组对象在接种之后的第3天和第7天，其PA菌落数均超过了106cfu//mL，而在第11天的时候其指数则超过104cfu/mL；定植组对象咽拭子在第3天和第7天的时候均能看见大量的PA菌被培养出来，到第11天时有所减少；定植组及对照组肺组织未见PA菌生长。

2.2 细胞因子测定

模型组、定植组还有对照组，其不同时间阶段血浆中IL-6、IL-8、IFN-γ还有TNF-α等水平指数变化，详情请见表1、表2。模型组中大鼠细胞因子的表达相对于其余两组要高出许多，对比有统计学意义（P＜0.05）；定植组和对照组两组之间指数对比无统计学意义（P＞0.05）；模型组中以第3天增高明显（P＜0.05）。

3 讨 论

铜绿假单胞菌（pseudomonad aeruginose，PA）是一种发病率高，致死性强的条件致病菌，近年来在院内感染、呼吸机相关性肺炎以及ICU病房其发病率不断增高，已成为该类人群致死致残的重要原因之一。

由于本实验中使用免疫抑制剂，使进入肺内的细菌不断繁殖及毒素产生，引起组织破坏严重。接种后第3天细菌数量多、毒力强，机体免疫功能低下，以多核白细胞浸润为主。多核白细胞是PA肺部感染早期主要的炎性细胞，其在清除病原体的同时也导致肺损伤。同时肺部PA感染时，能诱导体内炎性细胞因子表达增加，引起趋化肽释放，细菌及毒素入血增加进一步刺激细胞因子分泌，加重肺部炎症。随着时间延长，被抑制的免疫逐渐恢复，PA在体内被吞噬细胞清除，使存留在肺内的细菌数量减少，肺部炎症减轻同时炎性细胞因子释放减少，肺部损伤减轻。因而我们可以检测血清细胞因子IL-6、IL-8、IFN-γ 、TNF-α的水平，依靠这种差异有助于铜绿假单胞菌感染与定植的鉴别。由此我们通过检测血清细胞因子表达量的不同以期将感染与定植区分开，为临床鉴别诊断PA感染及定植提供有力的实验依据。

表1 各组大鼠不同时间血浆IL-6、IFN-Γ变化（，ng/L）

表1 各组大鼠不同时间血浆IL-6、IFN-Γ变化（，ng/L）

注：与定植组比较*P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05

模型组 定植组 对照组IL-6 IFN-γ IL-6 IFN-γ IL-6 IFN-γ 3 d 108.67±10.21* 96.16±7.49* 57.05±7.01 42.33±7.37 55.83±9.66 39.05±8.17 7 d 89.17±9.01* 84.16±9.08 * 52.01±8.98 41.53±6.44 50.33±6.92 38.63±8.89 11 d 75±7.72* 59.33±5.27* 53.03 32±5.71 46.01±9.61 50.17±7.42 44.67±8.77

表2 各组大鼠不同时间血浆IL-8、TNF-α变化（，ng/L）

表2 各组大鼠不同时间血浆IL-8、TNF-α变化（，ng/L）

注：与定植组比较*P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05

模型组 定植组 对照组IL-8 TNF-α IL-8 TNF-α IL-8 TNF-α 3 d 80.16±5.98* 121.83±11.72* 47.33±10.80 58.05±5.36 42.17±8.47 53.83±7.31 7 d 66.33±6.86* 83.66±11.34* 46.34±7.98 55.37±7.74 41.67±4.67 49.83±8.56 11 d 55.26±6.50* 67.01±7.04* 45.66±6.35 56.10±8.67 43.16±6.50 50.34±6.57

[1] Lglewski BH,Kabat D.NAD-dependent inhibition of protein synthesis by Pseudomonas aeruginasa toxin[J].Proc Natl Acad USA, 1975,72(6):2284-2288.

[2] 徐璇,钟礼立,张兵,等.荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立及价值[J].中国医师杂志,2006,8(12):1614-1617.

Study on the Changes of Cytokines for Differential Diagnosis of PA Infection and Colonization

FU Yu-qiong, RAN Mao-juan, ZHOU Wei, XIONG Bin, ZHAN Xiao-qin
(Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Luzhou Medcial College, Luzhou 646000, China)

Objective To explore the pseudomonas aeruginosa (PEA) toxic in pseudomonas aeruginosa lung infection and engraftment expression differences of clinical value. Methods 180 SD rats only randomly divided into PA (pseudomonas aeruginosa) infection model group, PA pharyngeal engraftment group and control group physiological saline. The lung tissue was observed by HE staining of lung inflammation under light. Results ①The results of bacterial culture:In the model group after inoculation with PA significantly increased lung colony number.②model group serum IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α group and control group with an engraftment significant difference. Conclusion Serum cytokines IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF- α detection is helpful in differential diagnosis of infection and colonization of Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas Aeruginosa Exotoxin; FQ-PCR

R563.1

：B

：1671-8194（2014）05-0029-02

*通讯作者：E-mail:490546615@qq.com