外界刺激对内源性生长因子TGF-β1的影响

顾令婉 周 莉 张 睿 李昱良 王 凯*

（遵义医学院附属口腔医院，贵州 遵义 563003）

外界刺激对内源性生长因子TGF-β1的影响

顾令婉 周 莉 张 睿 李昱良 王 凯*

（遵义医学院附属口腔医院，贵州 遵义 563003）

目的 观察备洞对家犬牙髓中TGF-β1表达的影响及修复性牙本质的形成情况，探讨牙本质牙髓复合体原位形成和内源性生长因子的相关性。方法 6只健康家犬，分别选取四颗磨牙，随机分为1、2、3、4四个组，每组6颗牙；1组不予任何处理，作为对照组，2、3、4组为实验组，分别给予长3 mm，宽3 mm，洞深2、2.5、3 mm的备洞刺激，予氧化锌丁香油粘固剂暂封窝洞，分别于2、4、6 周麻醉下拔除，制作病理切片，显微镜下观察修复性牙本质的形成情况，图像分析和免疫组化方法观察转化生长因子-β1的表达。结果 在2.5 mm洞深刺激强度下，2 周时，每组都没有修复性牙本质形成；3 mm洞深刺激强度，4、6周时，前期牙本质增宽，成牙本质细胞空泡变性，有第三期牙本质形成；每组都有转化生长因子-β1表达，结果表明：随着刺激度强和时间增加，呈表达增强趋势（P＜0.05）。结论 备洞刺激可能激活了内源性转化生长因子-β1，且可能参与了牙本质牙髓复合体的形成，内源性转化生长因子-β1的诱导表达与时间和刺激强度成正相关关系。

修复性牙本质；牙本质牙髓复合体；转化生长因子-β1

牙本质牙髓复合体构成了牙齿的主体，是高度特化的组织器官。窝洞制备、牙体预备、损伤、炎症、龋蚀等外界刺激因素均可给牙髓健康造成危害，诱导和加强牙本质牙髓复合体的原位形成，保护牙髓健康是牙髓生物学近年研究的热点。本文观察了家犬牙齿在不同强度刺激下，内源性生长因子转化生长因子-β1在牙髓中的表达情况和第三期牙本质形成情况，对内源性生长因子与牙本质牙髓复合体形成的相关关系进行探讨，期望为研究牙本质牙髓复合体的诱导形成提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

12～24个月龄家犬，每只分别选取四颗磨牙为实验对象，要求无明显磨耗、牙周、牙体健康。

1.2 实验器材

二步法免疫组化检测试剂（批号：K106629B）、浓缩型DAB试剂盒（批号：753223A）、TGF-β1兔抗体（Santa Cruz Biotechonlogy，Inc批号：K0410）（均购自北京中衫金桥生物技术公司）；高速涡轮机、光学显微镜等。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组：6只家犬，每只分别选取四颗磨牙，随机分为1、2、3、4四组，每组6颗牙；1组不作任何处理，作为对照组；2、3、4组作为实验组，3%戊巴比妥钠1 mL/kg经腹腔注射麻醉下，分别制备长3 mm，宽3 mm，洞深2、2.5、3 mm的窝洞，为外界刺激方式，立即给予丁氧膏封闭窝洞。为防止丁氧膏脱落，实验过程中均为软食喂养。

1.3.2 标本采集和处理：各组在完成实验后第2、4、6周，3%戊巴比妥钠1 mL/kg经腹腔注射麻醉下拔出实验牙，每次2只，10%中性甲醛盐溶液固定标本72 h，沿长轴将牙劈开，将牙髓组织完整取出，用5%硝酸浸泡牙体硬组织脱钙至软，常规制备组织切片，硬组织切片作HE染色，软组织切片作免疫组化染色。

1.3.3 结果观察及统计学处理：牙体硬组织中修复性牙本质的形成在光学显微镜下观察；通过Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析系统分析免疫组化染色结果，阳性信号为胞质和包膜出现黄色着色，棕黄色为强阳性，黄色为阳性，浅黄色为弱阳性，未染色为阴性。在免疫组化照片上按相同面积截取对成牙本质细胞层进行光密度值分析，黄色部分的IOD值表示该蛋白的表达水平，数据用统计软件SPSS13.0进行统计分析。所有数据均用（）表示。采用单因素方差分析对多组之间进行比较，P＜0.05表示差异有显着性。

2 结 果

2.1 HE染色结果

在2.5 mm制洞强度刺激下，2周时，每组都无修复性牙本质形成，在3 mm 制洞强度刺激下，4、6周时，有修复性牙本质形成，前期牙本质增宽，成牙本质细胞呈空泡变性，修复性牙本质与原发性牙本质之间有深色分隔条带（图1、2、3）。

2.2 免疫组化染色结果

2.2.1 镜下观察结果：转化生长因子-β1在各组牙髓组织中均有表达，1组和2组成牙本质细胞胞质和包膜染色呈浅黄色，表达呈弱阳性；3组和4组成牙本质细胞胞质和包膜染色呈黄色，表达呈阳性，其中4组在4周后染色呈棕黄色，表达呈强阳性；随时间和刺激强度增加，转化生长因子-β1表达逐渐增强（图4、5）。

2.2.2 图像分析结果：不同刺激强度和不同时间组经图像分析和比较:1、2组转化生长因子-β1的表达差异无显着性（P＞0.05）；1、3组，1、4组转化生长因子-β1表达差异有显着性（P＜0.05）；2、3、4组转化生长因子-β1的表达有显着性差异（P＜0.05）。

3 讨 论

牙本质牙髓复合体的原位形成包括了反应性牙本质和修复性牙本质。修复性牙本质也叫刺激性牙本质，是在比较强的刺激下形成的，特点是有管间牙本质的形成，牙本质小管数目减少。备洞等外界因素导致牙本质暴露及成牙本质细胞发生变性，由年轻成纤维细胞分化而来的成牙本质细胞或邻近的成牙本质细胞代替变性细胞在损害区形成牙本质，使得牙髓组织得以保护，免受不良刺激[1]。

图1 2周2.5 mm HE×40

图2 4周3 mm HE×40

图3 6周3 mm HE×40

图4 2周对照 HE×40

图5 2周2mm HE×40

研究表明：刺激性牙本质的形成依靠前体细胞分化为成牙本质细胞，而成牙本质细胞的合成和分泌活性增强有利于反应性牙本质的形成，因此，成牙本质细胞的分化和增殖是牙本质牙髓复合体形成的重要环节。TGF-β在多种组织细胞的分化增殖、组织损伤修复、骨质再实验虽然观察到TGF-β1的表达随时间和刺激强度的增加而增加，修复性牙本质的形成也与时间和刺激强度有关，但TGF-β1的表达在促进修复性牙本质形成的机制还不清楚；同时牙髓牙本质复合体能够承受刺激的最大阈值未见相关报道，当牙髓牙本质复合体失去修复能力时能否通过诱导TGF-β1的表达而增强其修复能力仍然需要进一步探索。

[1] 樊明文,周学东.牙体牙髓病学[M].北京:人民卫生出版社,2008.

[2] Smith AJ,Cassidy N,Perry H,et al.Reactionary dentinogenesis[J]. Int J Dev Biol,1995,39(1):273-280.

[3] Tziafas D,Papadimitriou S.Role of exogenous TGF-β in inductin of reparative denntinogenesis in vivo[J].Eur J Oral Sci,1998,106 (Suppl l):192.

[4] Smith AJ,Cassidy N,Perry H,et al.Reactionary dentinogenesis[J]. Int J Dev Biol,1995,39(1):273-280.

[5] 张倩,程祥荣,何俐,等.全冠牙体预备后影响牙髓-牙本质复合体反应因素的研究[J].武汉大学学报,2005,26(3):355-358.生、间质形成，以及胚胎发育中起着重要作用[2]。不仅对成牙本质细胞层的生物合成活性有增强刺激的效应，而且可使牙髓细胞发生增殖分化和迁移，对牙髓成纤维细胞具有强趋化作用。携带主要信息参与成牙本质细胞的分化，参与间充质与上皮间的信号传递，作为一种信号分子可能参与了成牙本质细胞的分化启动过程[3,4]。

实验采用的外界刺激因素为制备窝洞，观察了不同深度的制洞刺激下，内源性转化生长因子-β1在牙髓组织中的表达水平和刺激性牙本质形成情况，结果表明：2.5 mm刺激强度下，2周以前，每组都没有修复性牙本质形成，3 mm刺激强度下，4、6周时，有修复性牙本质形成前期牙本质增宽，成牙本质细胞发生空泡变性，修复性牙本质与原发性牙本质之间有深色分隔条带；各组牙髓组织中均有TGF-β1表达，且表达水平随刺激强度和时间呈增强趋势。但当刺激时间和刺激强度达到一定的程度，牙髓组织的修复能力不足以承受时，牙髓组织可能出现炎性反应，甚至牙髓坏死。张倩[5]等研究认为：当剩余牙本质厚度＜2.5 mm时，随着时间的增加，牙髓即可产生防御反应，6周左右能观察到刺激性牙本质形成，故本实验观察的最长时间为6周。

R78

：B

：1671-8194（2014）05-0055-02

贵州省卫生厅青年科技基金项目

*通讯作者：E-mail:297756834@qq.com