水源水中类固醇雌激素检测方法研究

贾佳 (浙江环科环境咨询有限公司,浙江杭州 310007)

张泽华 (浙江工业大学建筑工程学院,浙江杭州 310014)

马侠,宋崇渭 (浙江环科环境咨询有限公司,浙江杭州 310007)

水源水中类固醇雌激素检测方法研究

贾佳 (浙江环科环境咨询有限公司,浙江杭州 310007)

张泽华 (浙江工业大学建筑工程学院,浙江杭州 310014)

马侠,宋崇渭 (浙江环科环境咨询有限公司,浙江杭州 310007)

通过固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)联用的方法建立了水中微量共存类固醇雌激素(Steriod estrogens,SEs)——雌酮(Estrone,E1)、17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradiol, EE2)的同时检测分析方法。该方法具有操作简单、重现性好、准确度和精确度高等优点。对浙江省某市主要供水水源及河道景观用水进行为期一年的检测,水源水中E1、E2和EE2均有检出,水源水中E1和EE2检出率偏低,小于10%,检出最高浓度分别为56、97ng/L,EE2的存在水平较高;E2的检出最为频繁,检出率超过30%,最低浓度为70ng/L,最高浓度133ng/L;景观水中3种SEs的含量及检出频率均高于水源水,水环境中存在SEs痕量污染。

水源水;类固醇雌激素;雌酮;17β-雌二醇;17α-乙炔基雌二醇;固相萃取;高效液相色谱

类固醇雌激素(SEs)在极其微量(ng/L)的条件下即可对生物等产生很大的雌性化效应,近年来受到研究学者的广泛关注[1-5]。SEs包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、乙炔基雌二醇(EE2)和雌三醇(E3)等,均为四环分子结构,主要差别在于C-16和C-17位置上的基团种类和空间化学排列的差异。雌二醇根据C-17位羟基指向不同分为17α-雌二醇和17β-雌二醇,后者易被氧化成为雌酮,也可通过水合作用转化为雌三醇[6]。SEs在水体中的含量普遍较低,以痕量存在,如何快速、准确的实现其定量检测成为关键问题。

下面,笔者采用固相萃取-高效液相色谱法展开了水环境中微量SEs的检测,并通过该方法对浙江省某市水源水及景观水进行了为期一年的调查。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1)试剂 雌酮(标准品,≥99.5%,Dr.Ehrenstorfor Gmb H,德国);17α-乙炔基雌二醇(标准品, ≥99.3%,Dr.Ehrenstorfor Gmb H,德国);17β-雌二醇(标准品,≥96.8%,Dr.Ehrenstorfor Gmb H,德国);乙腈(色谱纯,99%,CNW,美国);甲醇(色谱纯,99%,CNW,美国);混合纤维素酯微孔滤膜(0.45μm,上海兴亚净化材料,上海);超纯水(18mΩ,Mili-Q,美国);去离子水(浙江工业大学)。

2)仪器 高效液相色谱仪(Agilent1200,安捷伦,美国)配Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm, 46×150mm,美国);12头固相萃取装置(CNW,美国);C18固相萃取小柱(500mg,3ml,CNW,美国);12孔氮吹仪(OA-SXS,美国);紫外可见分光光度计(heliosγ,SPR-200-510U,Thermo);玻璃砂芯过滤装置(浙江工业大学)。

1.2 试验方法

3种类固醇雌激素E1、E2、EE2分别溶解于10ml甲醇中,制备试验储备液。采用超纯水稀释储备液,配制成1g/L的SEs使用液,4℃密封保存。采用超纯水稀释,分别配制成浓度为0.5、1、2、5、7、10mg/L的系列标准样品,绘制SEs定量标准曲线。

固相萃取条件为10ml甲醇和10ml超纯水进行固相萃取小柱活化,流速2ml/min,以5ml/min的速度过水样,萃取结束后分别采用超纯水及10%的甲醇水溶液淋洗固相萃取柱,4ml甲醇洗脱,氮吹后定容为1ml,进行液相色谱分析,如需保存样品,则于-20℃保存。

分别取1L纯水、自来水与水源水经0.45μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤后投加适量雌激素使用液,分别配制成2.5μg/L和10μg/L的雌激素加标溶液,进行加标试验,考察方法检测限与精确度。试验用水的水质如表1所示。

表1 试验用水的水质

2 液相色谱检测条件

3种SEs结构相近,相对分子质量分别为E1(270.4)、E2(272.4)和EE2(296.4),且结构类似,试验中选取E2作为典型物质进行紫外光吸收测试试验。配制一定浓度的E2水溶液,紫外分光光度计下进行吸光度扫描确定物质吸光波长,结果如图1所示。从图1中可知,SEs在220 nm和280nm波长紫外光线照射下有强烈的紫外光吸收,这是因为其结构中含有—OH、C==C等吸光基团的作用。且类固醇雌激素在220nm下吸收效果优于280nm波长紫外光下的吸收。由于液相色谱通常采用溶剂甲醇和乙腈等作为流动相,这2中溶剂在紫外光下的截止波长分别为205nm和190nm,对类固醇雌激素的紫外光吸收不构成影响,故而在液相色谱检测中选用吸收波峰较大的220nm作为液相检测波长。

图1 190～900nm波长下雌激素吸光度

图2 3种类固醇雌激素液相色谱图

将配制好的3种SEs标准品分别液相进样,调节液相色谱要求目标物出现较好峰型,液相色谱条件为:流动相乙腈和水,比例50∶50,流速0.7ml/min,检测波长220nm,进样体积0.02μl,三者出现较好峰型如图2所示。3种SEs的出峰顺序为E2、EE2和E1,保留时间分别为4.9、6.0和7.0min,标准曲线分别为:

3 洗脱体积对固相萃取技术的影响

用纯水分别配制1L含E1、E2、EE2浓度为10μg/L和2.5μg/L的混合标准水溶液,固相萃取柱富集后,分别以1ml甲醇6次洗脱固相萃取小柱,液相进样检测洗脱的类固醇雌激素浓度,结果如表2所示。从表2中可知,甲醇洗脱固相萃取小柱吸附的类固醇雌激素主要集中于前面的2ml溶剂,从3～6ml甲醇洗脱开液中均未能检出类固醇雌激素,考虑到洗脱效果及试验耗时,试验中洗脱取4ml。

表2 洗脱体积对类固醇雌激素检出浓度的影响

4 加标回收率及方法精密度

选用之前确定的固相萃取条件和液相检测条件,进行加标试验,加标回收率结果如图3所示。由图3可见,纯水中固相萃取加标回收2.5μg/L的E2、EE2和E1的回收率分别为110.2%、96.9%和112.9%,原始浓度为10μg/L时E2、EE2和E1的回收率分别为93.6%、96.9%和94.1%,不同初始浓度均进行多次平行测定,结果标准偏差0.21%～5.44%。当以自来水及水源水为背景时,3种类固醇雌激素加标回收率也比较高,均位于86.8%～103.6%范围内,标准偏差均小于5.30,可见固相萃取可准确测定水环境中微量雌激素,符合方法测定要求。

精密度测试采用7个超纯水加标(10μg/L)样品进行平行测定,计算3种类固醇雌激素的含量及其标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD),结果如表3所示。由表3可见,固相萃取方法测定3种类固醇雌激素的RSD在0.65%～2.05%,控制在了U.S.EPA552.3方法规定的检测限的临界值20%以内,符合测定要求。

图3 加标回收率试验结果

表3 超纯水加标(10μg/L)样品中类固醇雌激素的检测结果(n=7)

5 实际应用

调查水样取自浙江省某市市区4个净水厂的进水水样,分别标注为1,2,3和4#,同时在市区景观河取水5#进行对比。

采用4L棕色玻璃瓶采集水样,取1L水样先用50目筛网过滤,后用玻璃砂芯滤斗经0.45μm滤膜过滤后24h内固相萃取预处理,并立即进行液相色谱检测,如不能立即检测则-4℃保存,并尽快预处理,水质及3种类固醇雌激素的含量如图4和图5所示。

一年调查期内,该市水源水水体p H 7.53～7.64,溶解氧6.50～6.65mg/L,高锰酸盐指数为2.97～3.26mg/L,氨氮0.69～1.4mg/L,总磷0.08～0.09mg/L,总氮1.99～3.99mg/L。根据《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002),从高锰酸盐指数判断水源水基本符合Ⅱ、Ⅲ类水质标准,但从氮磷的角度分析,水源水质偏差,处于富营养化状态。

景观水体质量相对水源水略差,p H值7.48～7.51,溶解氧为5.93～5.80mg/L,高锰酸盐指数为3.81～4.30mg/L,氨氮为1.81～2.32mg/L,总磷为0.10～0.12mg/L。水中氨氮偏高,处于劣Ⅴ水平。

调查数据表明,水源水中E1和EE2检出率偏低,小于10%,检出最高浓度分别为56、97ng/L,EE2的存在水平较高;E2的检出最为频繁,检出率超过30%,最低浓度为70ng/L,最高浓度133ng/L。景观水体中3种雌激素的含量检出率及检出浓度均高于水源水,检出率基本超过50%,E2 为100%。E1含量28～50ng/L,EE2含量74～99ng/L,E2含量60～101ng/L,这可能是由于景观处于居民闹市区,受周边生活居民影响,且水流速度过慢易于污染物富集所致。

图4 调查水源3种类固醇雌激素含量分析

图5 调查水源常规水质分析

6 结语

固相萃取-液相色谱法同时检测水环境中微量存在的3种类固醇雌激素,回收率可达90%以上,方法重现性好,准确度高,适合大批量样品的分析。

[1]Sun Y,Huang H,Sun Y,Wang C,et al.Ecological risk of estrogenic endocrine disrupting chemicals in sewage plant effluent and reclaimed water[J].Environmental Pollution,2013,180:339-344.

[2]Sales L B,Kamstra J H,Cenijn P H,et al.Effects of endocrine disrupting chemicals on in vitro global DNA methylation and adipocyte differentiation[J].Toxicology in Vitro,2013,27(6):1634-1643.

[3]Qiang Z M,Dong H Y,Zhu B Y,et al.A comparison of various rural wastewater treatment processes for the removal of endocrinedisrupting chemicals(EDCs)[J].Chemosphere,2013,92(8):986-992.

[4]Esteban S,Gorga M,Petrovic M,et al.Analysis and occurrence of endocrine-disrupting compounds and estrogenic activity in the surface waters of Central Spain[J].Science of The Total Environment,2014,466-467:939-951.

[5]李青松,高乃云,马晓雁,等.水处理工艺中甾体雌激素的去除及控制研究进展[J].水处理技术,2011,37(9):19-23.

[6]吴明红,任来堂,徐刚,等.甾体雌激素的污染水平及转化机制[J].自然杂志,2010,32(2):76-79.

[编辑]洪云飞

X703;TU99

A

1673-1409(2014)19-0023-04

2014-02-05

浙江省自然科学基金资助项目(LQ12E08013);江苏省环境科学与工程重点实验室开放基金资助项目(Zd131202);浙江省环境科学与工程重中之重学科开放基金资助项目(20130307)。

贾佳(1981-),女,硕士,工程师,现主要从事环境影响评价及环境咨询方面的研究工作。