SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性

麻文青 连福治 汪金泉 杨 磊,△

SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性

麻文青1连福治2汪金泉3杨 磊1,2△

目的 采用实时定量端粒重复序列扩增法（RQ-TRAP法）检测不同细胞端粒酶活性。方法用RQTRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12种细胞的端粒酶活性，并比较两种方法的检测结果。结果RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性，灵敏度可达8个细胞，扩增效率为98.92％。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有较强相关性（r2=0.762 5）。两种方法检测肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。结论RQ-TRAP方法检测端粒酶可行，比TRAP-ELISA方法成本低、时间短，且支持高通量，是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。

端粒；基因扩增；酶联免疫吸附测定；端粒酶活性；端粒重复序列扩增；TRAP-ELISA

端粒酶是一种核糖核蛋白复合体[1]。在绝大多数永生化细胞系和肿瘤细胞中端粒酶活性较高[2]。因此，端粒酶可能为肿瘤的诊断和治疗提供新的方向[3]。目前端粒酶活性的检测主要采用TRAP-ELISA 法[4]。但是该法存在检测时间长、成本相对较高等缺点。近年来，有研究将定量PCR与TRAP法结合起来，采用荧光染料SYBR Green，建立了SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法（RQ-TRAP法）[5]。本实验采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA法检测不同细胞端粒酶活性，旨在证实RQ-TRAP法的优势。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 细胞由本室保存及其他实验室惠赠，RPMI-1640培养基、DMEM培养基和新生胎牛血清均为Hy-Clone产品，TRAP-ELISA端粒酶检测试剂盒TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS购于Roche公司；RQ-TRAP引物参照文献序列如下：TS 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，ACX 5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。SYBR Green实时定量试剂盒购于TaKaRa公司，所用定量PCR仪为Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）。

1.2 细胞培养 所选细胞包括人肾上皮细胞系293T细胞、人肝癌细胞系HepG2细胞、人乳腺癌细胞系MCF7细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞、人肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC-12细胞、人结肠腺癌细胞系RKO细胞、人急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞、人淋巴瘤细胞系U937细胞和人卡巴式肉瘤相关疱症病毒感染细胞系BCBL-1细胞，以及人肝细胞系L-02细胞、人视网膜色素上皮细胞系D407细胞和鼠成纤维细胞系L929细胞。Jurkat细胞、U937细胞、BCBL-1细胞培养在含10％新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素溶液的RPMI-1640培养基中，其他细胞均常规培养在含10％新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，所有细胞均在37℃、5％CO2和95％相对湿度条件下孵育培养。每2～3 d传代1次。

1.3 细胞蛋白提取液的制备 RQ-TRAP用细胞蛋白提取液按Kim法制备：收集细胞，PBS冲洗1次，10 000×g4℃离心1 min收集细胞，沉淀细胞用预冷的洗液[10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸氢氧化钾（Hepes-KOH，pH 7.5），1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）]重悬，再离心，重悬1×104～1×106个细胞在20 μL预冷的细胞裂解液里[10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA），0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5％3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），10％甘油]。冰上孵育30 min，16 000×g4℃离心20 min，收集上清，迅速冷冻，-80℃保存。TRAP-ELISA用细胞蛋白提取液制备方法按照TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS（Roche Molecular Biochemicals）试剂盒说明制备。取5 μL的细胞提取液加入2 μL DNase-free RNase（0.5 g/L），37℃孵育20 min以灭活端粒酶，作为实验阴性对照。

1.4 RQ-TRAP检测端粒酶活性 依照参考文献[5]检测RQTRAP端粒酶活性，定量PCR采用Takara SYBR PremixEx TaqTM实时定量试剂盒（Takara DRR041A）。取5倍系列稀释的端粒酶阳性的293T细胞提取液（1 000、200、40、8个细胞），以及2种阴性对照样本分别作为PCR模板同时进行定量PCR反应。2种阴性对照按照如下方法设立。（1）以裂解液替代细胞提取液，用以监测PCR过程是否有污染。（2）RNase处理后，端粒酶RNA模板被降解，作为检测样本的自身对照。定量PCR反应体系（20µL）为：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 µL，PCR Forward Prime TS（10µmol/L）0.8µL，PCR Reverse Prime ACX（10µmol/L）0.4µL，ROX Reference Dye（50×）0.4 µL，模板（细胞提取液）1µL。PCR反应程序包括：（1）端粒延长，25℃孵育20 min。（2）端粒酶灭活，95℃5 min。（3）扩增循环，95℃变性5 s，60℃退火/延伸31 s，共40个循环。运用ABI7300软件采集和分析数据，通过软件可以计算出标准品和所有样品达到荧光阈值的循环数（Ct），以细胞数为横坐标轴，Ct值为纵坐标轴做标准曲线。取1 000个细胞制备的细胞提取液进行样品检测，评价方法为每个样品相对于同样细胞数293T细胞的端粒酶活性的比值。每个样本重复3次。

1.5 TRAP-ELISA法检测端粒酶活性 参照Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS试剂盒及文献操作说明进行操作。收集培养的活力良好的细胞并计数2×105个细胞，冷PBS洗2次，加裂解液200µL，冰上裂解30 min， 16 000×g低温离心20 min，取上清3µL加入TRAP反应液并加无核酸酶的水补足50µL进行PCR扩增，平行对照组于检测前经RNase处理。反应条件为：引物延长25℃30 min；端粒酶灭活94℃5 min；扩增条件：变性94℃30 s；退火50℃30 s；延伸72℃90 s循环30次。取2.5µL扩增产物，每个样品加10µL变性液，室温反应10 min，加杂交液100µL，充分混匀，将上述混合液体加入到链霉亲和素包被的微量反应板中，300 r/min 37℃孵育2 h；弃去杂交液,轻轻地用冲洗缓冲液清洗3次，向每孔中加入100µL抗地高辛过氧化物酶，300 r/min摇床室温30 min；弃去液体，用冲洗缓冲液清洗5次，加100µL TMB底物液，室温下观察颜色反应。端粒酶阳性时，液体由无色透明逐渐变蓝，加入终止液，颜色由蓝变黄。加入终止液后30 min，在酶标仪上测450 nm处吸光度值，参考波长为690 nm。每个样本重复3次。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示；RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法的关联性用线性回归模型分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RQ-TRAP标准曲线 4个浓度的293T细胞提取液均检测到扩增产物，而2种阴性对照均没有检测到扩增产物。随着模板浓度的降低，Ct值随着增大，但在8个细胞的裂解液中也能有效地检测出扩增产物，见图1A。PCR产物的熔解曲线显示为单峰，没有引物二聚体的形成，见图1B。PCR结果做标准曲线显示扩增斜率为-3.34，决定系数（R2）达到0.997，扩增效率为98.92％。

Fig.1 The standard curve of telomerase activity measured by RQ-TRAP图1 RQ-TRAP测定端粒酶活性标准曲线

2.2 RQ-TRAP与TRAP-ELISA检测端粒酶活性结果比较 两种方法测得12种细胞的相对端粒酶活性，见表1。两种方法测得的端粒酶活性存在相关性（r2=0.762 5，P＜0.05）。端粒酶活性结果还显示，两种方法测得的肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。

Tab.1 Comparison of telomerase activity measured by RQ-TRAP and TRAP-ELISA表1 RQ-TRAP和TRAP-ELISA测得相对端粒酶活性比较

3 讨论

本实验是采用端粒重复序列扩增和SYBR Green荧光定量PCR相结合的SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增（RQ-TRAP）方法检测端粒酶活性，以缩短操作时间、减少繁琐的扩增后操作步骤（如聚丙烯酰胺凝胶电泳或ELISA等）。实验采用Kim等[6]文献报道的TS和ACX引物，无引物二聚体的形成。同时RQ-TRAP方法能准确特异地检测12种细胞的端粒酶活性，且在8个细胞浓度时仍能有效地检测，显示该方法具有较高灵敏度。同时，扩增效率达98.92％，可高效率地检测端粒酶活性。

目前，TRAP-ELISA检测端粒酶活性方法较为常用，它具有灵敏、特异及可定量人端粒酶活性等优点，但是仍存在扩增后处理时间较长，成本相对较高等问题。近年来，有研究将定量PCR与TRAP法结合起来，采用荧光染料SYBR Green建立了一种新的端粒酶活性检测方法，即RQ-TRAP法。Wege等[5]研究认为TRAP-ELISA与RQ-TRAP有相关性，且RQ-TRAP有耗时短、线性结果可靠等优点。另外Hou等[7]的研究也表明RQ-TRAP方法是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。本实验将研究样本增加到12个细胞系，包括肿瘤细胞系和正常细胞系。利用RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法同时检测端粒酶活性，并对两种方法进行相关性分析，实验结果显示：9个肿瘤细胞系的相对端粒酶活性均高于3个正常细胞系，这一结果与普遍认为的肿瘤细胞有较高的端粒酶活性相一致。用RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA结果相关性为r2=0.762 5，表明RQ-TRAP方法可以作为一种检测端粒酶活性的方法，与TRAP-ELISA方法比较，它消除了扩增后复杂的ELISA过程，缩减了时间和繁琐的操作步骤，降低了成本，可以高通量进行,提高了检测效率，是一种可靠、能快速定量端粒酶活性的方法。

端粒酶在肿瘤组织中的检出率为85％～95％，而在非肿瘤组织和各种正常组织中其检出率为4％～6％[8]。本研究中3种正常细胞系的端粒酶活性均低于其他9个肿瘤细胞系，此结果符合目前研究成果，所以RQ-TRAP法是一种可靠地检测端粒酶活性的方法。

[1]Qi A,Zhou H,Zhou Z,et al.Telomerase activity increased and telomere length shortened in peripheral blood cells from patients with immune thrombocytopenia[J].J Clin Immunol,2013,33(3):577-585. doi:10.1007/s10875-012-9848-z.

[2]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer[J].Eur J Cancer,1997,33(5):787-791.

[3]Holysz H,Lipinska N,Paszel-Jaworska A,et al.Telomerase as a useful target in cancer fighting-the breast cancer case[J].Tumour Biol,2013,34(3):1371-1380.doi:10.1007/s13277-013-0757-4.

[4]Huang KZ,Nie DN,Yin SM,et al.Cyclin D1,hTERT expression and telomerase activity in HL-60 and HL-60A cell lines and their significance[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(4): 911-915.

[5]Wege H,Chui MS,Le HT,et al.SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity[J].Nucleic Acids Res,2003,31(2):E3-3.

[6]Kim NW,Wu F.Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP)[J].Nucleic Acids Res,1997,25(13):2595-2597.

[7]Hou M,Xu D,Bjorkholm M,et al.Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomerase activity[J].Clin Chem,2001,47(3):519-524.

[8]Gunes C,Rudolph KL.The role of telomeres in stem cells and cancer [J].Cell,2013,152(3):390-393.doi:10.1016/j.cell.2013.01.010.

（2014-02-21收稿 2014-03-31修回）

（本文编辑 魏杰）

Combined SYBR Green Real-Time with Telomeric Repeat Amplification Protocol(RQ-TRAP) to Detect Telomerase Activity

MA Wenqing1,LIAN Fuzhi2,WANG Jinquan3,YANG Lei1，2
1 Medical College，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2 Medical College，Hangzhou University;3 College of Life and Environmental Sciences,Shihezi University YANG Lei,E-mail：yanglei62@hznu.edu.cn

ObjectiveTo establish methodology to detect telomerase activity based on real-time quantitative PCR technique combined with telomeric repeat amplification protocol(TRAP).MethodsRQ-TRAP system was developed by combining real-time quantitative PCR technique with conventional TRAP method.Telomerase activity was assessed and compared by RQ-TRAP assay and TRAP connected with enzyme-linked immunosorbent assay(TRAP-ELISA)respectively in 12 kinds of cells.ResultsThe RQ-TRAP method was both accurate and specified in measuring telomerase activity in a series dilution of protein extracts from 293T cells.The sensitivity of this method was 8 cells and the amplification efficiency was 98.92％.Telomerase activity was not detected in negative control group.Statistical analysis revealed a strong correlation between the two assays(r2=0.762 5).ConclusionThe feasibility of RQ-TRAP was proved in this article.Compared with TRAP-ELISA,RQ-TRAP has many advantages.Apart from sample extraction and real-time PCR cycling,no other extra time-consuming steps are needed for telomerase quantification；RQ-TRAP is less costly and more rapid and reliable than TRAP-ELISA for quantification of telomerase activity and it also support high throughput.

telomere;gene amplification;enzyme-linked immunosorbent assay;telomerase activity；telomeric repeat amplification protocol；TRAP-ELISA

R34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.003

国家重大科学研究计划项目（2012CB911200）

1石河子大学医学院（邮编832000）；2杭州师范大学医学院；3石河子大学生命科学学院

△通讯作者 E-mail：yanglei62@hznu.edu.cn