葵花壳中绿原酸微波协助萃取工艺及清除羟基自由基的研究

李万林，钟姣姣，刘军海

（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001）

绿原酸又名咖啡酸，在植物界分布广泛，是植物在有氧呼吸阶段中产生的一种苯丙素类物质。其化学名为3-O-咖啡酰奎尼酸，分子式为C16H18O9，分子量为 345.30［1］。绿原酸是一种具有广泛生理活性和药理活性的物质，具有清除自由基、止血、提高白血球数量、抗菌消炎、保肝利胆和兴奋中枢神经系统等多种功效［2］。它是一种高效新型的酚型天然抗氧化剂，强抗氧化性使得它具有增香和护色作用，可用于食品和果品保鲜［3］。它也可用于防止饮料和食品的腐败变质。不仅如此，Wislka等人研究还发现，绿原酸可以提高草莓等果汁的稳定性。

葵花壳中绿原酸的提取对生产、生活都有相当重要的意义，笔者将微波协助萃取技术应用于葵花壳中绿原酸的提取，并对提取物进行抗氧化性清除羟基自由基的研究，可以为充分利用葵花壳提供理论依据，从而增加废弃物的利用价值。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

1.1.1 原料

葵花籽：汉中某大型农产品批发超市。

1.1.2 试剂材料

绿原酸标准品、无水乙醇、质量分数为30%的 H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、Vc（抗坏血酸）、稀盐酸、氢氧化钠等，均为市售AR试剂。

1.1.3 实验主要仪器

UWave-1000微波反应仪；UV-6300PC紫外可见分光光度计；DGG-9140B型鼓风干燥箱；KDF多功能食品粉碎机；标准检验筛：浙江上虞市道墟张兴纱筛厂；JY3002电子天平；HH-系列电热恒温水浴锅；旋片式真空泵。

1.2 实验方法

1.2.1 绘制绿原酸标准曲线

参照参考文献［4］的做法，按分光光度，测定出其吸光度，绘制绿原酸标准曲线方程，得到吸光度（y）与绿原酸浓度（x）之间满足 y=0.0395x+0.1124（R2=0.9994），该式说明在测定范围内线性关系良好。

1.2.2 原料预处理

为了去壳的便利，首先将葵花籽在较低的温度下（30℃ ）加热处理一段时间，待目测葵花壳差不多干燥时，取出，待温度降到室温。然后进行人工去壳，将所得的葵花壳放入铺展开的报纸上，置于60℃电热恒温鼓风干燥箱中进行烘干，接着用多功能食品粉碎机粉碎，过筛取直径小于0.05 mm的颗粒置于小烧杯中备用。

1.2.3 葵花壳中绿原酸的提取

准确称取1.2.2中小烧杯中葵花壳粉末2 g置于锥形瓶中，加入一定量的一定浓度的乙醇溶液作为萃取剂，然后利用微波协助萃取技术处理，将处理后的锥形瓶置于水浴锅中，趁热过滤两次，合并滤液。接着，将合并后的滤液迅速抽滤，将所得的滤液置于锥形瓶中备用。

1.2.4 葵花壳中绿原酸提取率计算公式

取1.2.3中锥形瓶中所得的滤液若干，在紫外可见分光光度计下进行分析，按下式计算绿原酸的提取率。

式中各符号表示如下：

w——葵花壳中绿原酸的提取率/mg/g

y——绿原酸滤液的吸光度

v——绿原酸滤液的体积/mL

n——滤液的稀释倍数

m——葵花壳粉末的质量/g

1.2.5 葵花壳中绿原酸对羟基自由基的清除实验

自由基被认为是人体衰老和某些慢性病发生的原因之一，当人体内的自由基产生过多或清除过慢，它就会攻击各种生物大分子，使正常的细胞和组织受损，加速其衰老并诱发多种疾病。在生物体内，需氧代谢的氧化还原反应所产生的羟基自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损伤膜结构及功能并引起各类疾病，因此对羟基自由基的清除实验具有重大的现实意义和医学意义。

分别在编号为 1、2、3、4、5 的试管中依次加入4 mL不同浓度的样品溶液、3 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、3 mL 8 mmol/L H2O2溶液，摇匀，静置 20 min，再加入3 mL 8 mmol/L水杨酸，摇匀，静置60 min后，在510 nm处测得不同浓度下的吸光度A1，用水代替水杨酸测得某样品浓度下的吸光度A2，用水代替样品溶液测得空白对照吸光度A0［5-6］。

按照不同编号记录上述相关数据，然后以相同浓度的抗坏血酸为阳性对照品，按照下式计算清除率。

2 葵花壳中绿原酸提取工艺优化

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度的影响

控制料液比（原料质量与萃取剂体积之比，下同）1：15，设置微波温度50℃ 、微波功率200 W、微波时间2 min，用稀盐酸或者稀氢氧化钠溶液调节pH值为7，分别研究在乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%时对葵花壳中绿原酸提取率的影响，结果见图1。

由图1可知：随着乙醇浓度的升高，葵花壳中绿原酸的提取率有一个先上升后下降的过程，在乙醇浓度为40%～60%之间，葵花壳中绿原酸的提取率随着乙醇浓度的升高而增大，在乙醇浓度为60%时绿原酸的提取率最高，故乙醇浓度选取60%为宜。

2.1.2 料液比的影响

取乙醇浓度为60%，在微波温度50℃、微波功率200 W 、微波时间2 min的条件下，将溶液 pH 值调节为 7，研究料液比为 1：10、1：15、1：20、1：25、1：30时，对葵花壳中绿原酸提取率有何影响，结果见图2。

由图2可知：随着料液比的增大，葵花壳中绿原酸提取率不断增大，因为此时单位质量葵花壳周围的乙醇含量增大，传质推动力增大，提取率变大；但当料液比大于1：20后，绿原酸的提取率趋缓，这是由于葵花壳中绿原酸已达溶解平衡，此时再增大料液比不但令生产成本增高而且会使后续的纯化过程复杂化，故料液比控制在1：20较合适。

2.1.3 微波温度的影响

取乙醇浓度为60%，在微波温度50℃、微波功率200 W、微波时间2 min的条件下，将溶液pH值调节为7，分别研究在微波温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃时对葵花壳中绿原酸提取率的影响，结果见图3。

由图3可知：在40℃ ～60℃之间，葵花壳中绿原酸提取率随着微波温度的升高而增大，在微波温度为60℃时，葵花壳中绿原酸提取率最高。在60℃～80℃ 之间，随着温度的升高绿原酸提取率反而下降，这可能是因为绿原酸随着温度的升高一部分已被分解，所以60℃为较佳微波温度。

2.1.4 微波功率的影响

取乙醇浓度为60% ，在料液比1：20、微波温度60℃ 、微波时间2 min的条件下，将溶液pH值调节为7，分别研究在微波功率为100 W、200 W、300 W、400 W、500 W时对葵花壳中绿原酸提取率的影响，结果见图4。

由图4可知：在微波功率100～300W之间，葵花壳中绿原酸提取率随微波功率的增大而增大，300W之后绿原酸提取率反而降低，功率过大产生的局部过热现象使绿原酸变性，提取率下降。因此，选择300W为最佳微波功率。

2.1.5 pH值的影响

取乙醇浓度为60%，在料液比1：20、微波功率300 W、微波时间2 min、微波温度60℃ 的条件下， 分别研究 pH 值为 4、5、6、7、8时对葵花壳中绿原酸提取率的影响，结果见图5。

由图5可知：当pH值为6时，葵花壳中绿原酸的提取效果最佳，而当提取环境处于过酸或碱条件下时，绿原酸的提取率反而都有所下降，这是由于在过酸或碱条件下，绿原酸可能会处于不稳定的状态，从而导致提取率的降低，故适宜的pH值为6。

2.2 正交试验优化方法设计

2.2.1 正交试验

在单因素实验基础上，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、微波温度（C）、微波功率（D）、pH（E）五个因素，设计5因素4水平的L16（45）正交试验，以进一步优化实验条件。正交试验的因素水平设计、实验结果及极差分析见表1、表2。

表1 正交因素水平设计表

参照上述表1安排，进行正交试验，正交试验的结果及极差分析见表2所示。

表2 正交试验结果及极差分析

由表2数据分析可知：微波协助萃取葵花壳中绿原酸的最佳工艺条件为：A2B2C2D2E2，即乙醇浓度60% 、料液比1：20、微波温度60℃、微波功率300 W、pH值6。极差分析可得：影响葵花壳中绿原酸提取率的因素顺序是C＞B＞A＞D＞E，即微波温度 ＞料液比＞乙醇浓度 ＞微波功率＞pH。

2.2.2 正交试验的方差分析

对表2实验数据进行方差分析，结果如表3所示。

表3 正交试验结果的方差分析

由表3方差分析可知：微波温度对微波协助萃取绿原酸的提取率影响显著，其他因素都不显著，因此，在实验提取过程中应该控制微波温度在合理的范围内，防止对绿原酸的提取产生较大的影响。同时出于节约能源方面考虑，可减少微波时间、料液比的投入量。

2.2.3 正交试验的结果

在最佳实验工艺提取条件下，安排验证性实验，即在乙醇浓度60%、料液比1：20、微波温度60℃ 、微波功率300 W 、pH值6的条件下，作平行实验3次，取其平均值，得葵花壳中绿原酸最终提取率为 5.862 mg/g。

2.3 羟基自由基清除实验结果及讨论

实验原理：fenton 反应［7］， 其实质是 H2O2在Fe2＋的催化作用下生成具有高反应活性的羟基自由基·OH，·OH可与大多数有机物作用使其降解［8］，若在体系内加入水杨酸，可与高反应活性的·OH反应生成有色物质，在510 nm处有最大吸收峰。若在体系内加入具有清除自由基作用的物质，它便会与水杨酸竞争，从而使有色物质的量减少。

按照 1.2.5中实验步骤进行相关操作，计算羟基自由基清除率，绘制双折现曲线如下图所示：

（图中“■”代表绿原酸粗提取物、“▲”代表对照品Vc）

由上双线坐标图上可以看出，在选定的浓度范围内（即 100 μg/mL ～ 500 μg/mL），葵花壳中绿原酸粗提取物开始就显示出较强的清除羟基自由基作用，且比阳性对照品抗坏血酸高，而且随着质量浓度的进一步增大，这种清除能力更强，清除效果更好，最大清除率可达60.42%。然而在同样浓度下，抗坏血酸的最大清除率为52.42%，二者相差8%，说明葵花壳中绿原酸粗提取物对·OH具有较强的的清除能力，可为开发清除自由基药物提供一定的实验依据。或许，在不久的将来，绿原酸可作为强清除自由基药物制剂投入生产。

3 实验结论

（1）通过微波法协助萃取葵花壳中绿原酸提取工艺条件的研究，可知：各因素对葵花壳中绿原酸提取率的影响次序为：微波温度 ＞料液比 ＞乙醇浓度＞微波功率＞pH。

（2）在乙醇浓度 60% 、料液比 1：20（g/mL）、微波温度60℃ 、微波功率300 W、pH值6、提取1次的最佳工艺条件下，葵花壳中绿原酸提取率为5.862 mg/g。葵花壳中的绿原酸粗提取物对·OH具有较强的清除能力，且其清除效果与Vc相比要更好。

［1］王辉，田呈瑞，马守磊，等.绿原酸的研究进展［J］.食品工业科技，2009， （5）： 341-345.

［2］李万林.金银花中微波辅助提取绿原酸工艺条件研究［J］.江西饲料，2013， （3）：3-6.

［3］戴自英.临床抗菌药物学［M］.北京：人民卫生出版社，1985：219-223.

［4］李万林.向日葵花盘中绿原酸的微波辅助提取工艺条件研究［J］.皮革与化工，2013，30（3）：14-18.

［5］Smirone N，Cumbes Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes ［J］.Phytochemistry，Polysaccharides to Hydroxyl Radieals，1989，28：1057-1060.

［6］李旭，刘婷.杜仲叶总黄酮微波辅助提取工艺的优化及其抗氧化活性研究 ［J］. 食品工业科技，2013， （3）：243-248.

［7］Chamarro E， Marcoa， Esplugass.Use of Fention reagent toimprove organic chemical biodegradability ［J］.Water Research，2001，35（4）：1 047-1 051.

［8］Li CW，Chen YM，Chiou YC， et al.Dye waste water treated by Fenton process with ferrous ions electrolytically generated from iron-containing sluge［J］.Journal of Hazardous Materials，2007，144（2）：95-108.