不同N/C比纳米碳氮膜对多壁碳纳米管抗凝血性能的影响

赵梦鲤，李德军，董 磊，刘小绮，曹 叶

（天津师范大学物理与材料科学学院，天津300387）

碳纳米管（CNTs）是继C60后被发现的碳的又一同素异形体[1]，由于具有大表面积、封闭的拓扑构形、丰富的电子结构、不同的螺旋结构、超轻重量、高化学和热稳定性以及高机械强度等特性，碳纳米管具有很多独特的理化性质，因此，在诸如医学诊断治疗、生物传感器和医学材料等研究和应用领域受到极大关注[2-7]，展现了广阔的应用前景.但随着对碳纳米管生物医学应用研究的不断加深，材料本身逐渐暴露出一定的缺陷和问题，如碳纳米管本身化学稳定性高，一般不溶于任何溶剂，所以在溶液中易聚集成团，这既妨碍了对其进行分子水平的操作和研究，也难于将它纳入生物体系，导致它在生物医学领域的应用受到限制[8-12].因此，为保留碳纳米管本身的优异性能，同时克服强疏水性的缺陷，采用物理或化学方法对其进行表面修饰是非常必要的.

在近些年的研究[13-15]中，碳氮膜（CNx）被证实具有良好的生物相容性和润湿性，是一种被认可的生物涂层材料.将CNx涂层覆盖在MWCNTs表面既可在拓扑结构上保持MWCNTs原有的大比表面积和高孔隙度的优势，又可借用CNx膜良好的润湿性，从表面性能上提高MWCNTs的亲水性.本课题组的前期工作已经发现，在MWCNTs表面沉积纳米碳氮膜可以有效提高MWCNTs的血液相容性[16-17].进一步考虑到作为生命体的必须元素，N元素参与蛋白质的合成和细胞表面识别等生命活动，具有生物活性，因此，N元素在材料中的含量和引入位置对其生物相容性的改善均有影响[18].本研究选择可在较低的轰击能量下连续沉积任意厚度膜层、并能在室温下合成具有理想化学配比化合物膜层的IBAD技术，通过控制实验参数，调节引入N元素的比率，在MWCNTs表面沉积不同N/C比率的纳米CNx薄膜，研究不同N含量CNx薄膜对MWCNTs抗凝血性的影响.

1 实验方法

1.1 沉积纳米CNx薄膜的MWCNTs的制备

MWCNTs（中国深圳市纳米港有限公司提供）纯度为 90%，直径为 40～50 nm，长度为 5～15 μm.为了方便生物实验，制备的MWCNTs材料需被喷涂在直径15 mm的圆形SiO2基片上，具体方法为：首先使用CVD设备在SiO2基片上烧制一层C层，以增加MWCNTs与SiO2基片之间的结合力；然后，将MWCNTs、十二烷基硫酸钠（SDS）和去离子水按质量比60∶3∶170的比例混合，置于容器中以功率400 W超声处理10 min后，按转速10 000 r/min离心15 min，最终形成稳定的悬浮溶液；接下来取悬浮液上层喷涂于基片上，为保证基片上的MWCNTs等量，每个基片喷涂4 mL碳纳米管悬浮液；最后，将喷涂后的样品置于去离子水中浸泡10 min，后置于蒸锅内高温高压（126℃，0.15 MPa）60 min除去SDS，取出后置于烘箱干燥即可.

MWCNTs的表面功能化采用高真空离子束辅助沉积系统（IBAD）.沉积过程中溅射气体选用纯度均为99.99%的氩气和氮气，本底真空为1.9×10-4Pa，工作气压保持在 1.2×10-2～1.3×10-2Pa.加速电压为 200 V，放电电压为70 V，使用溅射枪轰击纯度为99.9%的石墨靶，溅射能量为1.05 keV，溅射束流为25 mA；N离子辅助能量为200 eV，通过改变辅助枪的束流（5、15和25 mA）调节在MWCNTs样品上所沉积CNx膜的N/C比.

1.2 沉积纳米CNx薄膜的MWCNTs的结构特征测试

实验样品的结构表征采用JEOL JSM-6700F型扫描电子显微镜（SEM），极性功能基团成分、含量、分布和键合状态分析使用PHI5000型X线能谱仪（1 486.6 eV的Al Kα射线源），通过CAM KSV021733型光学接触角测量仪测试表面功能化前后水在碳纳米管材料样品上的接触角.

1.3 沉积纳米CNx薄膜的MWCNTs的抗凝血性测试

血液相容性中最为关键的部分是血栓生成.采用血小板黏附实验和动态凝血实验测试MWCNTs和沉积纳米CNx薄膜的MWCNTs的抗凝血性能.

取MWCNTs和表面沉积不同N/C比CNx膜的MWCNTs样品各3片，分别放入24孔板中.阴性对照组3片，放有与实验材料同尺寸并涂有2%甲基硅油的SiO2基片；阳性对照组3片，为与实验材料同尺寸的SiO2基片.健康新西兰兔耳动脉取血10 mL，加入抗凝剂离心10 min，将获得的富含血小板的血浆滴在样品、阴性和阳性对照组的表面，并在37℃条件下培养15 min，拿出计数，统计血小板黏附率.计算血小板在样品表面黏附率的方法为：

式（1）中：A为抗凝血中的血小板数；B为与材料作用后的抗凝血中的血小板数.为保证实验结果的可靠性，本实验重复3次，最终结果取3次平行实验的统计平均值.另准备一组，在SEM下观察样品表面黏附血小板的形态.

凝血实验是检测凝血因子、反映凝血机理的重要手段和指标.动态凝血时间实验反映了血液中游离的血红蛋白的溶解状况和血液在材料表面的凝血程度.实验取新鲜的健康兔血，每个样品上滴加0.1 mL，并开始计时.5、10、20、30、40和 50 min时依次进行统计，统计时每种材料各取出1个样品放到含有50 mL蒸馏水的烧杯中，均匀震荡.此时没有形成血栓的血红细胞将被溶解，血红蛋白自由分散在溶液中，使用天津喀纳斯光学分析仪器有限公司生产的721型分光光度计，在540 nm的波长下测量样品的光密度（O.D.540nm），光密度值越高，说明形成血栓的红细胞越少，材料的抗凝血性越优秀.同样，取3次平行试验的平均值，将O.D.540nm平均值绘成动态凝血时间曲线图.

2 结果与讨论

图1为喷涂在SiO2表面的MWCNTs的表面形貌.

图1 样品的SEM图Fig.1 SEM images of the samples

从图1（a）可以看出，喷涂在SiO2基片上的MWCNTs结构疏松，表面粗糙，存在大量孔洞.而在MWCNTs表面沉积CNx膜后，材料表面形貌略微平整，孔洞减少，且随着辅助枪束流的增大，表面形貌更加平整，如图 1（b）、1（c）和 1（d）所示.这一方面是因为 CNx膜包覆在MWCNTs表面，使得材料表面平整；另一方面，随着束流的增大，被离子束打断的MWCNTs数目增多，也填补了MWCNTs材料表面的孔洞，使材料更加平整.通过实验前在Si片表面测试沉积率可知，改变辅助枪束流基本不影响沉积CNx薄膜的厚度，CNx的沉积率为19～20 nm/h.实验沉积时间为30 min，因此覆盖在MWCNTs表面的CNx薄膜厚度约为10nm.

同时，材料水接触角的实验结果反映出：MWCNTs具有很强的疏水性，接触角达到135.80°，如图2（a）所示.在MWCNTs表面沉积纳米CNx膜后，样品亲水性明显提高，材料由疏水性物质转变为亲水性物质，如图 2（b）、图 2（c）和图 2（d）所示.由图 2 可以看出，随着辅助枪束流的增大，沉积纳米CNx膜的MWCNTs亲水性不断提高，当束流为25 mA时，样品的接触角达到最小值24.72°.材料抗凝血性的优劣与材料表面的粗糙程度和亲水性相关，在一定范围内，材料表面越平滑、亲水性越好，其抗凝血性就越好[19-20].综合SEM和接触角的测试结果，在MWCNTs上沉积纳米CNx膜可以改善MWCNTs材料的抗凝血性；同时，随着辅助枪束流的增大，沉积CNx膜的MWCNTs材料的抗凝血性变得更加优异.

图2 样品的接触角图Fig.2 Contact angle images of the samples

为确定沉积CNx膜MWCNTs中N和C两元素的含量及成键状态，对MWCNTs和沉积CNx膜的MWCNTs样品进行XPS分析，结果如表1和图3所示.

表1 MWCNTs和沉积CNx膜的MWCNTs的原子百分比（%）和结合能（eV）Tab.1 Atomic content percent and binding energy of MWCNTs with and without CNxcoatings

图3 样品的XPS谱图Fig.3 XPS spectra of the samples

由表1可知，XPS结果显示MWCNTs中含有0.53%的N，这是由于制备所得MWCNTs在结构上疏松多孔（如图1（a）所示），暴露在空气中，表面吸附有空气中的N2所致；沉积纳米CNx膜的MWCNTs中N含量受辅助枪束流大小的影响，辅助枪束流为5、15和25 mA时，N元素含量依次为17.04%、21.34%和17.54%，换算成N和C两原子的比例（N/C）依次为0.20、0.27和 0.21，记为 CN0.20、CN0.27和 CN0.21.由此可见，辅助枪束流的大小与材料含氮量高低相关，辅助枪束流过高或过低均不利于N元素在MWCNTs材料上的积累，为获得较高的含N量，15 mA的辅助枪束流较为合适.

图3为表面功能化前后的碳纳米管经高斯拟合的 C1s和 N1s谱图.由图 3（a）可以看出，MWCNTs中只存在C峰，C元素之间以sp2C—C（284.7eV）和sp3C—C（285.6 eV）两种杂化方式结合.沉积纳米CNx（x=0.20、0.27和0.21）膜的MWCNTs的N1s谱图显示，N元素以sp2N—C（400.1 eV）和sp3N—C（398.7 eV）2种键合状态存在于CNx薄膜中，且从N1s谱图中可以看出，sp3N—C杂化占主要成分，并且随着N/C比的增加，sp3N—C键的比例也随之增大.

图4显示了MWCNTs和沉积CNx（x=0.20、0.27和0.21）膜MWCNTs样品表面血小板的黏附率.

图4 样品表面的血小板黏附率Fig.4 Adhension rates of platelets on the samples

由图4可以看出，几种材料表面血小板黏附的大小依次为：阳性对照组>MWCNTs>沉积CN0.27膜的MWCNTs>沉积CN0.20膜的MWCNTs>沉积CN0.21膜的MWCNTs>阴性对照组.因此，在碳纳米管表面沉积CNx膜有效地抑制了血小板黏附和血栓形成.影响材料抗凝血性能的因素主要有样品的表面粗糙度、亲疏水性和表面电荷分布等.表面粗糙意味着大的表面积，血小板越容易黏附，抗凝血性能就会越差[21].因此，CNx膜作为一种光滑薄膜覆盖在MWCNTs表面，可以有效降低材料表面粗糙度，进而达到抑制血小板黏附的目的.由接触角的测试结果可知，沉积CN0.21膜的MWCNTs的亲水性最强，因此其表面黏附的血小板数目最少.此外，血栓在材料表面的形成与纤维蛋白原表面电荷转移到材料表面有关，当纤维蛋白原失去电荷后会转变成纤维蛋白单体和血纤维蛋白肽，这种交联的纤维蛋白单体最终导致血栓的形成[22-23].由CNx薄膜中N原子的电子结构看，5个价电子中的4个形成与C原子价电子类似的结构，1个剩余.sp3杂化中，这个剩余电子将填充到4个sp3轨道中的任意1个，形成1个三角锥形的三键和1对孤对电子[24-26].所以，沉积CNx薄膜的MWCNTs具有优于MWCNTs的抗凝血性的原因是由于CNx薄膜中孤对电子的存在阻碍了电荷从纤维蛋白原向材料表面的转移，进而抑制了纤维蛋白原向交联纤维蛋白单体转化，提高了抗凝血性.

图5显示了扫描电镜下MWCNTs和沉积CNx（x=0.27、0.21）膜MWCNTs材料表面的血小板形态.

图5 血小板和红细胞在不同样品表面的扫描电镜图Fig.5 SEM images of the platelets and red cells adhered on different samples

由图5（a）可以看出，黏附在MWCNTs表面的部分红细胞变形，说明MWCNTs对血小板具有一定的毒副作用；同时，黏附其上的血小板变形严重，伸出细长伪足，团聚纠缠在一起，易形成血栓.由图5（b）和图5（c）可知，沉积CNx膜的MWCNTs表面红细胞呈圆饼状，无变形，说明表面的CNx膜降低了MWCNTs对红细胞的毒性，且黏附在材料表面的血小板团聚少，伪足短小，分布分散，不易形成血栓.对比图4（b）和图4（c）还可以发现，沉积CN0.21膜的MWCNTs表面血小板最为分散，变形最少，验证了血小板黏附率的测试结果.

图6显示了MWCNTs和沉积CNx膜MWCNTs的动态凝血时间.动态凝血时间曲线越平缓，说明凝血时间（O.D.540nm=0.10时的时间定为凝血时间）越长，凝血因子被激活的程度越低，材料的抗凝血性越好.从图6中可以发现，沉积3种不同N/C比CNx膜的MWCNTs的凝血曲线均较MWCNTs的平滑，且OD值达到0.10的时间更晚，这说明在碳纳米管表面沉积CNx膜可以达到延长材料动态凝血时间的目的，且随着N/C比的增高，凝血时间不断增长，凝血因子在沉积CNx膜的MWCNTs材料上被激活的程度越低，其抗凝血性越优秀.

3 结论

本研究采用离子束辅助沉积（IBAD）方法在MWCNTs表面沉积纳米CNx薄膜，通过控制氮气辅助枪束流来控制薄膜中的含氮量.实验发现：在MWCNTs表面沉积纳米CNx薄膜可降低MWCNTs材料的表面粗糙度，显著提高MWCNTs的亲水性，血液在沉积纳米CNx薄膜MWCNTs表面的动态凝血时间长，血小板黏附率低，红细胞形态健康，这说明使用物理方法在MWCNTs表面沉积纳米CNx薄膜成功达到了改善MWCNTs抗凝血性的目的.同时，样品表面粗糙程度、亲水性和抗凝血性的提高对应较高的辅助枪束流和含氮量，说明抗凝血性的优劣不是单一因素作用的结果，为达到最优化沉积CNx薄膜MWCNTs抗凝血性的目的，需要综合考虑N含量、粗糙度和亲水性等因素，在尽量提高氮元素含量的同时减小粗糙度，提高亲水性.离子束辅助沉积方法可通过调节轰击能量和束流大小等条件控制达到抗凝血性最优值，该方法在生物医用材料改性方面具有良好的发展前景和应用价值.

[1]HOFFMANN J，GROLL J，HEUTS J，et al.Blood cell and plasma protein repellent properties of star-PEG-modified surfaces[J].J Biomater Sci Polym Ed，2006，17（7）：985-996.

[2]SHI D L.Integrated multifunctional nanosystems for medical diagnosis and treatment[J].Adv Func Mater，2009，19（21）：3356-3373.

[3]RAFFA V，CIOFANI G，NITODAS S，et al.Can the properties of carbon nanotubes influence their internalization by living cells[J].Carbon，2008，46（11）：1600-1610.

[4]LI J，NG H T，CASSELL A，et al.Carbon nanotube nanoelectrode array for ultrasensitive DNA detection[J].Nano Lett，2003，3（12）：597-602.

[5]PORTNEY N G，OZKAN M.Nano-oncology：Drug delivery，imaging，and sensing[J].Anal Bioanal Chem，2006，384（3）：620-630.

[6]SMARTA S K，CASSADYB A I，LUA G Q，et al.The biocompatibility of carbon nanotubes[J].Carbon，2006，44（6）：1034-1047.

[7]CHLOPEK J，CZAJKOWSKA B，SZARANIEC B，et al.In vitro studies of carbon nanotubes biocompatibility[J].Carbon，2006，44（5）：1106-1111.

[8]STARK N J.Biological evaluation of medical devices-Part 4：Selection of tests for interactions with blood[S].Internation Standard.ISO 10993-4：2002（E）：1-17.

[9]WETTERO J，ASKENDAL A，BENGTSSON T，et al.On the binding of complement to solid artificial surfaces in vitro[J].Biomaterials，2002，21（4）：981-987.

[10]HARRISON B S，ATALA A.Carbon nanotube applications for tissue engineering[J].Biomaterials，2007，28（2）：344-353.

[11]YANG M，YANG Y，YANG H，et al.Layer-by-layer self-assembled multi-layer films of carbon nanotubes and platinum nanoparticles with poly-electrolyte for the fabrication of biosensors[J].Biomaterials，2006，27（2）：246-255.

[12]LACERDA L，BIANCO A，PRATO M，et al.Carbon nanotubes as nanomedicines：From toxicology to pharmacology[J].Adv Drug Deliv Rev，2006，58（14）：1460-1470.

[13]WU Z R，ZHANG M，CUI F Z.Adhesion and growth of smooth muscle cells on CNx coatings[J].Surf Coat Technol，2007，201（9/10/11）：5710-5715.

[14]ZHAO M L，LI D J，ZHANG Y T，et al.In vitro comparison of the hemocompatibility of diamond-like carbon and carbon nitride coatings with different atomic percentages of N[J].Science China Life Sciences，2012，55（4）：343-348.

[15]TANG L，LIU L，ELWING H B.Complement activation and inflammation triggered by model biomaterial surfaces[J].J Biomed Mater Res，1998，41（4）：333-339.

[16]ZHAO M L，LI D J，GU H Q，et al.In vitro cell adhesion and hemocompatibility of carbon nanotubes with CNx coating[J].Current Nanoscience，2012，8（3）：451-457.

[17]ZHAO M L，LI D J，GUO M X，et al.The different N concentrations induced cytocompatibility and hemocompatibility of MWCNTs with CNxcoatings[J].Surface&Coatings Technology，2013，229：90-96.

[18]ALEXEEVA T A，LEBOVKA N I，GUNKO V M，et al.Characteristics of interfacial water affected by proteins absorbed on activated carbon[J].J Celloid Interface Sci，2004，278：333-341.

[19]HUANG W J，SHIRAL F，LAWRENCE F，et al.Solubilization of single-walled carbon nanotubes with diamine-terminated oligomeric poly（ethylene glycol）in different functionalization reactions[J].Nano Lett，2003，3（10）：565-568.

[20]ROBERT J C，SARUNYA B，KATERINA A D，et al.Noncovalent functionalization of carbon nanotubes for highly specific electronic biosensors[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（9）：4984-4989.

[21]MOONSUB S，NADINE W S K，ROBERT J C，et al.Functionalization of carbon nanotubes for biocompatibility and biomolecular recognition[J].Nano Lett，2002，2（4）：285-288.

[22]BAURSCHMIDT P，SCHALDACH M.Alloplastic materials for heartvalve prostheses[J].Med Biol Eng Comput，1980，18（6）：496-502.

[23]ZHANG L，CHEN M，LI Z Y，et al.Effect of annealing on structure and haemocompatibility of tetrahedral amorphous hydrogenated carbon films[J].Mater Lett，2008，62（6/7）：1040-1043.

[24]TITANTAH J T，LAMOEN D.Carbon and nitrogen 1s energy levels in amorphous carbon nitride systems：XPS interpretation using first-principles[J].Dia Rel Mater，2007，16（3）：581-588.

[25]HULTMAN L，NEIDHARDT J，HELLGREN N，et al.Fullerene-like carbon nitride：A resilient coating material[J].MRS Bull，2003，28（3）：194-202.

[26]FERRARI A C，KLEINSORGE B，MORRISON N A，et al.Stress reduction and bond stability during thermal annealing of tetrahedral amorphous carbon[J].J Appl Phys，1999，85：7191-7197.