间接ELISA在过敏性哮喘模型干预性实验中检测IgE含量的应用

郭海涛，杨光勇，何光志

（贵阳中医学院，贵州贵阳550002）

过敏性哮喘（Allergic Asthma）是临床上最常见的支气管哮喘类型，所占比例高达70%，儿童和青少年更可高达80%，其发病机制主要与IgE介导的变态反应有关，而任何类型的哮喘患者其血清IgE水平均增高[1]。为了探讨间接ELISA法在检测过敏性哮喘模型血清IgE中的应用价值。本文通过制备过敏性哮喘模型，建立间接ELISA方法检测实验动物血清中的IgE的含量，用来观察IgE含量的变化。本研究拟在哮喘病的临床检测中提供实验依据。

1 试剂与材料

1.1 材料 普通SD大鼠（批号：SCXK(渝)2012-0005），购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司；超声雾化器，购自深圳美久阳公司（型号：MY-520A）。

1.2 试 剂 Rat IgE ELISA Kit（ 批 号：20140224SE），由上海鑫乐生物科技有限公司提供；灭活的百日咳杆菌原液，由北京天坛生物制品股份有限公司提供；卵清蛋白（OVA，美国Sigma公司生产，批号：326A057），北京索莱宝生物科技有限公司提供；氢氧化铝（Al(OH)3）（批号：980819），购自贵阳东新化工有限公司。雷诺考特（布地奈德鼻喷雾剂产品，批号：国药准字J20090079）。

2 方法

2.1 过敏性哮喘模型的建立及干预实验 把SD大鼠45只（其中雄性23只，雌性22只）随机分为三组：哮喘组（15只）、空白对照组（15只）和西药治疗组（15只）。

致敏阶段：哮喘组和西药治疗组分别在腹部皮下三处注射10%的OVA混合液1ml(含OVA 100mg、Al(OH)3 100mg及灭活的百日咳杆菌5×109个)进行致敏，空白对照组也在腹部皮下三处注射生理盐水1ml。1周后再进行致敏。

激发阶段：第2次致敏1周后进行激发。把哮喘组和西药治疗组的大鼠放入自制的不完全封闭的箱中，接超声雾化器放气管；每次放入5只大鼠，5%OVA生理盐水30min（约10mL），连续10d进行激发；空白对照组用生理盐水替代OVA进行雾化吸入。每次雾化激发前30min，对西药治疗组的大鼠，腹腔注射治疗剂量的布地奈德稀释液[2]，对空白对照组注射同等体积的生理盐水。

2.2 标本采集 SD大鼠过敏性哮喘模型的建立，采用OVA进行雾化的造模方法[3]。根据症状、组织病理学等[4]来证实造模是否成功，造模后分别用10%的水合氯醛溶液对哮喘组、空白对照组和西药治疗组大鼠进行腹腔麻醉后处死，股动脉取全血，采用4500r/min离心5min，取上清液无菌分装，置于-20℃低温冰箱保存备用。

2.3 标准品浓度梯度及血清最佳稀释倍数的确定 将试剂盒中的SD大鼠IgE标准品（24U/ml）用标准品稀释液按照1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32 倍比作梯度稀释。将SD大鼠阴性血清按照同样的梯度用标准品稀释液分别进行稀释。将两组稀释液分别加入酶标板中（标准品每孔加50μL，阴性血清每孔加40μL），阴性血清每孔加入抗-IgE抗体10μL/孔，23℃孵育2h,用ELISA试剂盒中的洗液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素50μL/孔，23℃反应45min，经洗涤后分别加入显色剂A和B各50μL/孔，避光，23℃反应30min。最后加入终止液50μL/孔，终止反应，30min内用酶标仪在450nm波长下测定OD值。选择阳性血清与阴性血清在浓度梯度范围内的OD450的比值（P/N）最大所对应的稀释倍数作为判断标准。

2.4 ELISA方法的建立 用350μL/孔洗液洗酶标板两次，再加入350μL/孔洗液静置浸泡15min，弃洗液，用吸水纸拍干，在湿润状态下立即使用酶标板；将待检测的血清按照最佳稀释倍数加入酶标板，40μL/孔；加入ELISA试剂盒中的抗-IGE抗体10μL/孔；封板膜封板，在恒温振荡器中，100转/min，23℃孵育2h；弃掉液体，加入350μL/孔洗液，23℃静置15s，弃洗液，再加入300μL/孔洗液，在恒温振荡器中，23℃，100转/min，振荡3min，弃洗液，此为一个洗板循环，如此循环洗板3次，用吸水纸拍干；加入最佳工作浓度的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素50μL/孔，封板膜封板，在恒温振荡器中，100转/min，23℃孵育45min；再次使用洗板循环3次洗板，用吸水纸拍干；加入分别加入显色剂A和B各50μL/孔，避光，23℃恒温箱孵育30min；最后加入终止液，50μL/孔，终止反应，用酶标仪进行OD450和OD630双波长测定。

2.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定 酶标二抗按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32作倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清样本，进而确定酶标二抗的最佳工作浓度。

2.6 ELISA阴阳临界值的确定 取5份同批次正常SD大鼠血清进行ELISA检测。同时设阳性和阴性对照。计算出本批次SD的大鼠OD450的()和标准差（s），按+3s公式计算阴阳临界值。

2.7 特异性实验 用本次试验建立的ELISA方法分别检测含有IFN-γ、IL-4的标准阳性血清各5份，同时设IgE标准品5份为对照，鉴定该方法的特异性。

2.8 间接ELISA检测IgE的应用 用本次实验建立的间接ELISA方法检测空白对照组、哮喘组和西药治疗组实验动物血清中的IgE的含量。

2.9 统计学方法 各组大鼠血清中IgE测定值采用统计学软件SPSS21.0进行统计学分析，所测数据以±s表示，组间比较用t检验和单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 过敏性哮喘模型的观察 外观观察：与其他组相比，哮喘组出现呼吸加深加快，点头呼吸、张口呼吸、毛色黯淡无光、反应迟钝、出现抓脸现象，听诊有哮鸣音。

病理观察：HE染色可见对照组肺泡大小正常，肺泡隔未见增宽，未见炎细胞浸润（图1）；哮喘组肺泡隔纤维组织增生，部分肺泡萎缩，间质内见慢性炎细胞浸润（淋巴细胞、浆细胞、单核细胞嗜酸性粒细胞）（图2）；西药治疗组肺泡大小不等，肺泡隔增宽，间质纤维组织增生，并见炎细胞浸润（淋巴细胞、浆细胞、单核细胞，未见嗜酸性粒细胞，炎细胞分布以血管周较多，炎细胞数量较模型组稍减少）（图3）。根据外观的表现和病理学观察，证明造模成功。

3.2 标准品浓度梯度及血清最佳稀释倍数的测定 用ELISA试剂盒标准阳性血清和已知SD大鼠阴性血清进行测定（3次重复），测得OD450。由表可知SD大鼠血清最佳稀释倍数为1:1（表1）。

表1 标准品梯度和血清最佳稀释倍数确定（OD450 值）

图1 对照组HE 染色（200×）

图2 哮喘组HE 染色（200×）

图3 西药治疗组（200×）

表2 酶标二抗最佳工作浓度的确定（OD450 值）

表3 临界值确定（OD450 值）

表4 ELISA 检测IgE（OD450 值，n=10）

3.3 酶标二抗最佳工作浓度的测定 选取阳性对照OD450大于1.0，阴性对照0.261，阴、阳性对照差异最大作为酶标二抗的稀释度即为最佳工作浓度，结果可见酶标二抗1:4的稀释浓度为最佳工作浓度（表2）。

3.4 临界值确定 取5份相同批次的阴性SD大鼠血清采用ELISA检测，每个样品重复检测1次，测得OD450以+3s公式计算，以（0.7075+3×0.014849）为临界值，计算出临界值为0.752（表3）。

3.5 特异性实验结果 用本次实验建立的ELISA方法分别检测含有IFN-γ、IL-4的标准阳性血清各5份，同时设IgE标准品5份为对照，结果显示含有IgE标准阳性血清OD450大于0.752，另外两个标准品OD450均小于0.752。说明本次试验建立的ELISA方法具有较强的特异性。

3.6 间接ELISA检测IgE的应用 用本实验建立的ELISA法检测空白对照组、哮喘组和西药治疗组IgE含量，经SPSS分析统计发现哮喘组血清中的IgE的OD450值（0.944±0.083）比空白对照组（0.687±0.039）明显升高（P<0.05），西药治疗组（0.859±0.014）比哮喘组血清中的IgE含量降低（P<0.05）（表4）。

4 讨论

过敏性哮喘是一种由多种炎症细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞等共同参与的慢性过敏性气道炎症性疾病，气道平滑肌痉挛和气道高反应性为本病的两大特征[5]，其具体发病机制目前尚不完全清楚。研究表明过敏性哮喘关键的效应细胞是Th细胞[6]，Th主要包括两种细胞Th 1和Th 2，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ 等细胞因子，而IFN-γ 可以对抗Th2细胞的功能[7]，抑制IgE的合成；Th2主要分泌IL-3、IL-4、IL-5和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等，并能促进IgE的合成。在过敏性哮喘急性发作期，出现T细胞免疫调节作用失常，表现为Th2细胞功能亢进，Th1细胞功能低下，Th1/Th2比值低于正常，使得IgE被大量产生[8]，进而使肥大细胞脱颗粒反应，释放白三烯、组胺、嗜酸性粒细胞趋化因子和血小板活化因子等，这些因子引起支气管平滑肌痉挛、粘膜水肿、分泌增多等，使得支气管腔狭窄，气流受限，从而促进哮喘的发生发展[9-10]。通过检测患者血清中IgE的含量，可以对过敏性哮喘的发生发展及治疗情况进行早期诊断。

ELISA方法是一种免疫学技术，因其原理是抗原抗体特异性结合，具有较高的特异性，而且方法简单、时间短，易于操作，适合在实验条件差的基层采用[11]。本实验通过ELISA方法检测了空白对照组、哮喘组和西药治疗组大鼠血清IgE的OD450，经统计学分析发现，哮喘组和西药治疗组大鼠血清IgE的OD450都有所增高，尤其哮喘模型组增高最明显（P<0.05），提示哮喘组IgE的含量在质上有所改变；而西药治疗组IgE低于哮喘组有统计学差异（P<0.05），但高于空白对照组IgE水平（P<0.05）。研究结果表明ELISA方法适用于哮喘病的临床检测IgE含量。

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