分子标记技术的产生与引物设计

2014-08-12 18:44张羽
江苏农业科学 2014年6期
关键词:分子标记核苷酸差异

摘要:基因组DNA碱基的转换/颠换、插入/缺失及重排等变化会导致生物个体之间的差异,这种变化可能是发生在编码区、非编码区、内切酶识别序列、启动子、调控序列等,由此产生了各类分子标记技术。笔者基于分子标记研究,从基因组碱基序列变化角度对各类分子标记产生的根源及引物设计等方面内容进行综述,以期为更好掌握和运用分子标记提供参考。

关键词:核苷酸;序列;差异;分子标记;引物设计

中图分类号: Q78文献标志码: A文章编号:1002-1302(2014)06-0047-05

收稿日期:2013-09-06

基金项目:陕西省农业科技创新项目(编号:NKC01-01)。

作者简介:张羽(1968—),女,陕西汉中人,硕士,副教授,从事遗传学理论与实践等教学和科研工作。E-mail:zy68169@sina.com。生物的遗传信息都蕴藏在碱基序列中,基因组碱基的转换、颠换以及插入、缺失等变化会导致个体与个体之间的差异,即表现出生物的遗传多样性,这种特性既能传递又能以多种形式表现出来,这就是通常所说的遗传标记。遗传标记具有可遗传性和可识别性,人们可以通过追踪生物的性状、染色体、染色体某一片段、蛋白质或DNA序列在家系中传递的规律和变化来研究生物的遗传变异。因此,这种遗传特性可以通过形态学、细胞学、生化及分子水平上的差异来表现,也就是说生物任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。DNA 分子标记是以DNA分子的多态性为基础的遗传标记,它反映了生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA 片段。与其他标记相比,DNA分子标记具有无可比拟的优越性:直接以DNA形式表现,既不受环境影响,也不受生物组织、发育时期影响;标记的数量多、多态性高;表现为中性,不影响目标性状的表达;许多标记表现为共显性,能区别纯合体和杂合体;成本不太高等。目前主要有基于分子杂交的DNA标记技术和基于PCR的分子标记技术两大类,基于分子杂交的DNA标记技术主要有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP)、可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)、原位杂交(in situ hybridization,ISH)等;以PCR为核心的分子标记技术主要有随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)等。

1第1代分子标记技术

1.1RFLP技术

1974年,RFLP技术第1次被用于遗传分析[1-2],它是一种以DNA-DNA杂交为基础的第1代遗传标记,是最早的DNA标记技术。RFLP技术的依据是限制性酶切位点上碱基的缺失/插入、重排和点突变而导致的基因型之间的限制性片段长度差异,利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA。由于碱基组成不同,得到大小不等的酶切DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况,再通过凝胶电泳形成不同带型,最后用经标记的相应DNA探针与这些片段进行杂交,通过放射自显影而显示出的图谱就可以反映出不同个体基因组DNA序列之间的差异。如图1所示,个体a1、个体a2的基因组序列中有EcoRⅠ位点,但是由于碱基的插入/缺失,导致各自的EcoRⅠ酶切位点的位置不同。通过EcoRⅠ酶切后,个体a2除了形成与个体a1相同长度的片段外,还有一个长度不一的片段(比个体a1长约15 bp的片段);由于个体a3在EcoRⅠ位点发生点突变,EcoRⅠ的酶切序列GAATTC变成了BamHⅠ的酶切序列GGATCC,因此用EcoRⅠ酶切,则产生不了片段,但用BamHⅠ酶切,个体a3出现条带,而个体a1和个体a2不出现条带。RFLP具有数目多、共显性、不受环境影响、多态性高等特点,但RFLP技术对样品要求高,DNA 必需是大分子,因此在抽提DNA过程中要避免DNA断裂,限制性内切酶酶切消化要彻底;此外,制作杂交探针较困难,试验操作较繁锁,检测周期长,成本费用高。

1.2VNTR技术

VNTR别称小卫星DNA(minisatellite DNA),真核生物基因组中有2类可变的串联重复序列,根据核心序列(重复序列)的长度分为小卫星和微卫星,其中小卫星重复单位的核心序列为15到几十甚至几百个核苷酸,一般位于基因组高变区,是基因组中的重组热点,拷贝数达数百次不等,呈现出丰富的长度多态性[3-4]。VNTR技术的原理与RFLP技术大致相同,首先选择在VNTR特异序列上的无酶切位点(保证小卫星序列的完整性)的限制性内切酶将总基因组DNA切成不同长度的片段,然后以VNTR中的特异序列为探针进行Southern杂交,放射自显影后就可检测到很多小卫星位点。如图2所示,小卫星重复单位的核心序列为GGAGGTGGGCAGGAGG,在个体b1中核心序列重复了8次,记为(GGAGGTGGGCAGGAGG)8;个体b2中重复了7次,记为(GGAGGTGGGCAGGAGG)7;个体b3中核心序列重复了10次,记为(GGAGGTGGGCAGGAGG)10。因此,用VNTR标记就会形成3个不同长度的多态性,其中个体b2的扩增片段最短,个体b1比个体b2扩增片段长约16 bp的片段,个体b3比个体b2扩增出长约48 bp的片段。由此可以看出,VNTR数量有限,在基因组上分布不均匀;同时,VNTR技术具有试验操作繁琐、检测时间长、成本高等缺点。

2第2代DNA分子标记技术

2.1RAPD技术

1990 年,Welsh等第1次提出RAPD[5-6]。RAPD技术是以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物而进行的PCR 扩增技术。RAPD技术通常使用10个左右碱基的随机单链引物,由于基因组中存在很多反向序列,因此RAPD扩增的是正向序列和反向序列之间的片段,引物在DNA模板上有很多结合位点,只有当2个引物结合位点较近且方向相反时,扩增才能进行。如果2个引物结合点彼此背离,扩增不会发生;引物结合点在相同的方向,扩增也不会发生;引物之间彼此相隔太远(>2 000 bp),扩增也不会发生。引物结合位点DNA序列的改变可能导致引物无法与模板结合,从而扩增无法进行或扩增片段数目改变。2个扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入等导致扩增片段数目和长度的差异。如图3所示,用10 bp的随机引物GCTGCTATCT进行扩增,个体c1将得到扩增长度约111 bp的片段,个体c2将得到扩增长度约74 bp的片段,个体c3由于发生点突变,引物无法与模板配对,因此扩增不出片段。RAPD 技术由于不涉及分子杂交和放射性自显影技术,引物为完全随机引物,因此设计引物时无须知道模板序列信息。RAPD 技术具有引物成本较低、DNA需要量少、技术简便、操作方便、快速、引物通用等特点。但RAPD大多为显性遗传,不能鉴别显性纯合子和杂合子;RAPD技术的试验重复性较差,结果可靠性较低。

2.2AFLP技术

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)由Zabeau等在1995年创立,是基于PCR技术选择性扩增基因组DNA限制性片段的技术[7]。AFLP技术先用限制性内切酶切割基因组DNA,一般采用双酶切,双酶切中一种为低频剪切酶,另一种为高频剪切酶,目前常用的是MseⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ酶组合,其中EcoRⅠ为6个碱基识别位点的低频剪切酶,MseⅠ为4个碱基识别位点的高频剪切酶。双酶切后得到大小不等的酶切DNA片段,产生的DNA片段长度一般小于500 bp,然后在其两端接上双链人工接头,接头由1个核心序列和1个酶切序列组成,一般为14~18 bp。如图4所示,连上接头的酶切片段就是DNA模板,引物由与人工接头互补的5′端核心序列(GACTGCGTA)、对应于限制性酶切片段限制性末端的特异性酶切序列(CCAATT)及3′端选择性碱基(CCACCT)三部分构成,引物的3′端选择性碱基识别接头序列和相邻的限制性位点序列,扩增片段的特异性由选择性碱基的种类、数目和顺序决定,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才能被扩增出来。扩增产物可以用放射性同位素标记或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来检测个体之间的差异。AFLP技术预先不需要知道被测基因组DNA信息,是在RAPD技术和RFLP技术基础上发展起来的一种半随机PCR技术,但是操作中通常要利用同位素标记,对样品DNA质量要求高。

2.3SSR技术

SSR别微卫星DNA(micro satellite)、简单序列重复多态性(simple sequence repeat polymorphisms,SSRP)或短串联重复序列(short tandem repeat,STR)。简单序列重复是一类由 2~6 bp 碱基组成的基序(核心序列)串联重复而成的DNA序列,重复几十次,基因位点长度一般在100~300 bp,其中最常见是2种碱基重复,如(AT)n、(AC)n等[8]。SSR在真核生物基因组中呈随机分布,大约每隔10~50 kb就存在1个,但不同物种中的重复序列及重复单位频率不同。同一物种内碱基种类不同的SSR,其丰度差别也很大。微卫星DNA两端的序列一般都很保守,可以根据其两端的保守序列设计1对特异引物,再利用PCR技术扩增每个位点的微卫星DNA序列,通过电泳分析核心序列的长度多态性[9]。SSR变异产生的原理如图5所示,在个体d1中的基序为(GA)21,个体d2中为(GA)16,根据其两端的保守序列设计的引物为5′-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-3′和3′-ACTTTACCCTTTCCTAGTGG-5′,其中个体d1预期扩增片段长度为184 bp,个体d2预期扩增片段长度为174 bp。

SSR具有呈共显性遗传的特点,可鉴别杂合子和纯合子,并且SSR技术所需DNA量少。但是缺点是SSR具有相对的物种专一性,引物不能通用;以已知微卫星序列两端的单拷贝序列来设计引物,需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程;不同引物退火温度不同,需要进行试验探索。

3第3代DNA分子标记技术

3.1SNP标记技术

1996年,Vos等提出SNP技术,主要是指由基因组核苷酸水平上的单碱基的转换、颠换变异引起的DNA序列多态性[10-11]。如图6所示,对2个个体的部分核苷酸序列进行比较发现,其中个体e1中的碱基G颠换成个体e2中的碱基T,出现了1个SNP。SNP是许多物种基因组中最常见的变异形式,在基因组中的分布频率很高,近年来,SNPs在人类[12-17]、老鼠[18]、拟南芥[19]、大麦[20-21]、大豆[22]、甜瓜[23]、玉米[24]和水稻[25-28]等多个物种中的高密度分布已有报道。作为第3代分子标记,SNP具有在基因组中数量多、分布密度高等特点,而且在基因分型过程中不需要根据片段大小将DNA分带,可以大规模高度自动化地完成,比以SSR标记为代表的第2代分子标记密度高。SNP标记技术高效率的工作特点,更适于大量样本的检测分析。目前检测SNP的最佳方法是 DNA芯片技术,SNP标记则被认为是很有应用前景的分子标记技术[29-30]。

SNP不是长度多态性,在设计引物时须将突变碱基落在突变引物的3′端,根据Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性的特点,3′末端错配碱基的引物,其延伸速度低于正常末端碱基配对的引物的延伸速度,因此特异性扩增条带就不会出现,从而就表明模板DNA与引物3′末端没有相应的突变;反之则表明模板DNA 上存在与引物3′末端相应的突变碱基。以图6为例,个体e1的引物为5′-CACCGAAGATAGAAATGGAC-3′、

3′-CAGAGTAGAGGTAATTTTGT- 5′;个体e2的引物为5′-CACCGAAGATAGAAATGGAA 3′、3′- CAGAGTAGAGGTAATTTTGT - 5′。个体e1和个体e2的特异性引物只在3′端有1个碱基的差异,而它们的反向引物是相同的,反向引物的位置决定了扩增片段的长度,如图6所示的扩增片段大小约为157 bp。为了增加扩增的特异性,可以在个体e1或个体e2的正向引物的3′端第3位上引入1个错配,如5′- CACCGAAGATA GAA A TGAAC -3′[31]。由酶切序列的改变产生的分子标记如RFLP、CAPS等,由于涉及到分子杂交、放射性元素的利用及限制性内切酶消化不完全带来的基因型判读错误等问题,可把这类标记转化成SNP标记得以实现。

3.2InDels标记技术

InDels(insert delete)标记即插入/缺失标记技术[32],指几个碱基的插入或缺失。很多研究人员把单碱基的插入/缺失也称为SNP。如图7所示,个体f1和个体f2的核苷酸序列出现了1个InDels标记,个体f1和个体f2之间只相差了2 bp,虽然从理论上讲,聚丙烯酰胺凝胶可以区分1 bp的差异,但试验条件要求很高才能区分2 bp的差异:凝胶要很薄,电泳时间也要比常规时间长。InDels标记为长度多态性,因此在此序列区域内设计InDels引物时,用长度多态性来区分这2个个体的效果往往不理想。

如果2个个体的核苷酸序列相比较,插入/缺失碱基数目较多,则可以用长度多态性区分。如图8所示,个体g1与个体g2的核苷酸序列相比,不仅出现了3个SNPs,还有8 bp的InDels,这就使得在此碱基序列区域内开发的引物不仅容易区分2个个体,而且特异性更强[33]。

4分子标记技术的发展

分子标记作为一种高通量、能自动检测基因组中核苷酸序列变化的标记方法,已经被广泛应用于动植物的遗传研究中,主要集中在基因定位[34-36]、辅助育种选择[37-39]、功能基因鉴定[40-42]、遗传多样性分析[43-45]、疾病诊断与治疗[46-48]等方面。各类分子标记的开发都是基于基因组核苷酸序列的差异,这种差异可能是内切酶识别序列的差异、编码区的差异、非编码区的差异、启动子的差异、调控序列的差异等。这些差异可以是错义突变、移码突变,导致氨基酸变化引起表型变异,也可能是产生无义突变而导致多肽链的翻译提前终止,从而产生无功能的蛋白质。另外,由于氨基酸密码子的兼并性,这种差异可以导致沉默突变而不影响氨基酸的翻译,在表型上没有变化。因此,分子标记用在辅助育种进行选择及作为疾病诊断的特异标记时,必须把基因型与表现型结合起来。随着功能基因组时代的到来,开发并应用与功能基因紧密连锁的分子标记,特别是利用基因本身序列开发的功能分子标记,已成为鉴定和选择目的基因的有效途径。理想的分子标记要具有多态性高、共显性遗传、开发成本和使用成本尽量低廉、检测手段简单快速、重复性好的特点。随着分子生物学、基因组学等理论与技术的发展,必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术。

参考文献:

[1]Grodzicker T,Williams J,Sharp P,et al. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses[J]. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology,1975,39(Pt 1):439-446.

[2]Botstein D,White R L,Skolnick M,et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics,1980,32(3):314-331.

[3]Jeffreys A J,Wilson V,Thein S L. Hypervariable ‘minisatellite regions in human DNA[J]. Nature,1985,314(7):67-73.

[4]Nakamura Y,Leppert M,OConnell P,et al. Variable number of tandem repeat(VNTR) markers for human gene mapping[J]. Science,1987,235(4796):1616-1622.

[5]Welsh J,Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J]. Nucleic Acids Research,1990,18(24):7213-7218.

[6]Williams J G,Kubelik A R,Livak K J,et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Research,1990,18(22):6531-6535.

[7]Zabeau M,Vos P. Selective restriction fragment amplification:a general method for DNA fingerprinting:Europeau,EP 05344858A1[P]. 1992-09-24.

[8]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genome,1994,20(2):176-183.

[9]Li C,Zhang Y,Ying K,et al. Sequence variations of simple sequence repeats on chromosome-4 in two subspecies of the Asian cultivated rice[J]. TAG. 2004,108(3):392-400.

[10]Vos P,Hogres R,Bleeker M,et al. A new technique for DNA finger printing[J]. Nucleic Acids Research,1995,23(21):4407-4414.

[11]Chee M,Yang R,Hubbell E,et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays[J]. Science,1996,274(5287):610-614.

[12]Collins F S,Guyer M S,Charkravarti A. Variations on a theme:cataloging human DNA sequence variation[J]. Science,1997,278(5343):1580-1581.

[13]李东霞,苏秀兰. 人类基因组的新型遗传标记:STR和SNP[J]. 内蒙古医学院学报,2006,28(1):61-66.

[14]宋沁馨,周国华. 用Cy5-ddNTP结合修饰引物延伸测定人类3种SNP(英文)[J]. 中国药科大学学报,2006,37(6):569-572.

[15]Sachidanandam R,Weissman D,Schmidt S C,et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms[J]. Nature,2001,409(6822):928-933.

[16]Hoque M O,Lee C C,Cairns P,et al. Genome-wide genetic characterization of bladder Cancer:a comparison of high-density single-nucleotide polymorphism arrays and PCR-based microsatellite analysis[J]. Cancer Research,2003,63(9):2216-2222.

[17]Leuin B. Genes Ⅶ[M]. 余龙,江松敏,赵寿员,译. 北京:科学出版社,2005.

[18]Lindblad-Toh K,Winchester E,Daly M J,et al. Large-scale discovery and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse[J]. Nature Genetics,2000,24(4):381-386.

[19]Cho R J,Mindrinos M,Richards D R,et al. Genome-wide mapping with biallelic markers in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Genetics,1999,23(2):203-207.

[20]Kato R,Varshney R K,Thiel T,et al. Generation and comparision of EST-derived SSRs and SNPs in barley[J]. Hereditas,2001,135(2/3):145-151.

[21]Kanazin V,Talbert H,See D,et al. Discovery and assay of single-nucleotide polymorphisms in barley(Hordeum vulgare)[J]. Plant Molecular Biology,2002,48(5/6):529-537.

[22]Zhu Y L,Song Q J,Hyten D L,et al. Single-nucleotide polymorphisms in soybean[J]. Genetics,2003,163(3):1123-1134.

[23]Morales M,Roig E,Monforte A J,et al. Single-nucleotide polymorphisms detected in expressed sequence tags of melon(Cucumis melo L.)[J]. Genome,2004,47(2):352-360.

[24]Batley J,Barker G,OSullivan H,et al. Mining for single nucleotide polymorphisms and insertions/deletions in maize expressed sequence tag data[J]. Plant Physiology,2003,132(1):84-91.

[25]Nasu S,Suzuki J,Ohta R,et al. Search for an analysis of single nucleotide polymorphism(SNP)in rice and establishment of SNP markers[J]. DNA Research,2002,9(5):163-171.

[26]Feltus F A,Wan J,Schulze S R,et al. An SNP resource for rice genetics and breeding based on subspecies indica and japonica genome alignments[J]. Genome Research,2004,14(9):1812-1819.

[27]Shen Y J,Jiang H,Jin J P,et al. Development of genome-wide DNA polymorphism database for map-based cloning of rice genes[J]. Plant Physiology,2004,135(3):1198-1205.

[28]张羽,张晓娟,杨凤娇,等. 水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta的SNP检测方法[J]. 中国水稻科学,2013,27(3):325-328.

[29]Olivier M,Chuang L M,Chang M S,et al. High-throughput genotyping of single nucleotide polymorphisms using new biplex invader technology[J]. Nucleic Acids Research,2002,30(12):e53.

[30]Jiang M C,Jiang P C,Liao C F,et al. A modified mutation detection method for large-scale cloning of the possible single nucleotide polymorphism sequences[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2005,38(2):191-197.

[31]管峰,杨利国,艾君涛,等. 四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊 BMPR-IB基因型方法的建立[J]. 遗传,2005,27(4):579-583.

[32]吴磊,王丹,苏文悦,等. 利用比较基因组学开发山羊草属InDel分子标记[J]. 作物学报,2012,38(7):1334-1338.

[33]张羽,王胜宝,冯志峰,等. 陕西省水稻种质资源的香味基因检测[J]. 西北农林科技大学学报:自然科学版,2011,39(4):55-59,68.

[34]曾晓珊,杨先锋,赵正洪,等. 稻瘟病抗病基因Pia的抗性分析及精细定位[J]. 中国科学:生命科学,2011,41(1):70-77.

[35]Zhu X Y,Chen S,Yang J Y,et al. The identification of Pi50(t),a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9 multigene family[J]. Theoretical and Applied Genetics,2012,124(7):1295-1304.

[36]张帆涛,方军,孙昌辉,等. 水稻矮秆突变体dtl1的分离鉴定及其突变基因的精细定位[J]. 遗传,2012,34(1):79-86.

[37]Jiang H C,Feng Y T,Bao L,et al. Improving blast resistance of Jin 23B and its hybrid rice by marker-assisted gene pyramiding[J]. Molecular Breeding,2012,30(4):1679-1688.

[38]文绍山,高必军. 利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9(t)渗入水稻恢复系泸恢17[J]. 分子植物育种,2012,10(1):42-47.

[39]柳武革,王丰,金素娟,等. 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性[J]. 作物学报,2008,34(7):1128-1136.

[40]陈洁,胡茂林,张亮,等. 小麦持久抗病品种N. Strampelli的抗条锈病基因分析和微卫星标记[J]. 植物病理学报,2010,40(4):388-394.

[41]王金明,林秀云,刘晓梅,等. 分子标记选择水稻抗稻瘟病基因Pi40和Pib聚合体[J]. 华北农学报,2012,27(2):218-221.

[42]张羽,王胜宝,刘鑫,等. 等位基因特异扩增检测水稻抗稻瘟病基因Pi-ta[J]. 西北农业学报,2013,22(3):44-49.

[43]张羽,李新生,冯志峰,等. 陕西省有色稻资源的SSR多态性分析[J]. 植物遗传资源学报,2011,12(5):828-832.

[44]张羽,李新生,冯志峰,等. 陕西省水稻种质资源的遗传多样性分析和指纹图谱构建[J]. 西北农业学报,2011,20(12):59-65.

[45]Tacconi G,Baldassarre V,Lanzanova C,et al. Polymorphism analysis of genomic regions associated with broad-spectrum effective blast resistance genes for marker development in rice[J]. Molecular Breeding,2010,26(4):595-617.

[46]阮黎,张旭,马鑫,等. 膀胱移行细胞癌E-钙粘连素基因启动子C/A单核苷酸多态性与肿瘤复发的关系[J]. 中华试验外科杂志,2005,22(1):9-11.

[47]王伟,张斌. 少突胶质细胞瘤的诊断和分子标记物研究进展[J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2009,8(4):374-375.

[48]杨国华,王磊,宫玉艳,等. 应用分子标记对Duchenne型肌营养不良胎儿的产前基因诊断[J]. 武汉大学学报:医学版,2009,30(6):756-758,766.

[28]张羽,张晓娟,杨凤娇,等. 水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta的SNP检测方法[J]. 中国水稻科学,2013,27(3):325-328.

[29]Olivier M,Chuang L M,Chang M S,et al. High-throughput genotyping of single nucleotide polymorphisms using new biplex invader technology[J]. Nucleic Acids Research,2002,30(12):e53.

[30]Jiang M C,Jiang P C,Liao C F,et al. A modified mutation detection method for large-scale cloning of the possible single nucleotide polymorphism sequences[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2005,38(2):191-197.

[31]管峰,杨利国,艾君涛,等. 四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊 BMPR-IB基因型方法的建立[J]. 遗传,2005,27(4):579-583.

[32]吴磊,王丹,苏文悦,等. 利用比较基因组学开发山羊草属InDel分子标记[J]. 作物学报,2012,38(7):1334-1338.

[33]张羽,王胜宝,冯志峰,等. 陕西省水稻种质资源的香味基因检测[J]. 西北农林科技大学学报:自然科学版,2011,39(4):55-59,68.

[34]曾晓珊,杨先锋,赵正洪,等. 稻瘟病抗病基因Pia的抗性分析及精细定位[J]. 中国科学:生命科学,2011,41(1):70-77.

[35]Zhu X Y,Chen S,Yang J Y,et al. The identification of Pi50(t),a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9 multigene family[J]. Theoretical and Applied Genetics,2012,124(7):1295-1304.

[36]张帆涛,方军,孙昌辉,等. 水稻矮秆突变体dtl1的分离鉴定及其突变基因的精细定位[J]. 遗传,2012,34(1):79-86.

[37]Jiang H C,Feng Y T,Bao L,et al. Improving blast resistance of Jin 23B and its hybrid rice by marker-assisted gene pyramiding[J]. Molecular Breeding,2012,30(4):1679-1688.

[38]文绍山,高必军. 利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9(t)渗入水稻恢复系泸恢17[J]. 分子植物育种,2012,10(1):42-47.

[39]柳武革,王丰,金素娟,等. 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性[J]. 作物学报,2008,34(7):1128-1136.

[40]陈洁,胡茂林,张亮,等. 小麦持久抗病品种N. Strampelli的抗条锈病基因分析和微卫星标记[J]. 植物病理学报,2010,40(4):388-394.

[41]王金明,林秀云,刘晓梅,等. 分子标记选择水稻抗稻瘟病基因Pi40和Pib聚合体[J]. 华北农学报,2012,27(2):218-221.

[42]张羽,王胜宝,刘鑫,等. 等位基因特异扩增检测水稻抗稻瘟病基因Pi-ta[J]. 西北农业学报,2013,22(3):44-49.

[43]张羽,李新生,冯志峰,等. 陕西省有色稻资源的SSR多态性分析[J]. 植物遗传资源学报,2011,12(5):828-832.

[44]张羽,李新生,冯志峰,等. 陕西省水稻种质资源的遗传多样性分析和指纹图谱构建[J]. 西北农业学报,2011,20(12):59-65.

[45]Tacconi G,Baldassarre V,Lanzanova C,et al. Polymorphism analysis of genomic regions associated with broad-spectrum effective blast resistance genes for marker development in rice[J]. Molecular Breeding,2010,26(4):595-617.

[46]阮黎,张旭,马鑫,等. 膀胱移行细胞癌E-钙粘连素基因启动子C/A单核苷酸多态性与肿瘤复发的关系[J]. 中华试验外科杂志,2005,22(1):9-11.

[47]王伟,张斌. 少突胶质细胞瘤的诊断和分子标记物研究进展[J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2009,8(4):374-375.

[48]杨国华,王磊,宫玉艳,等. 应用分子标记对Duchenne型肌营养不良胎儿的产前基因诊断[J]. 武汉大学学报:医学版,2009,30(6):756-758,766.

[28]张羽,张晓娟,杨凤娇,等. 水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta的SNP检测方法[J]. 中国水稻科学,2013,27(3):325-328.

[29]Olivier M,Chuang L M,Chang M S,et al. High-throughput genotyping of single nucleotide polymorphisms using new biplex invader technology[J]. Nucleic Acids Research,2002,30(12):e53.

[30]Jiang M C,Jiang P C,Liao C F,et al. A modified mutation detection method for large-scale cloning of the possible single nucleotide polymorphism sequences[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2005,38(2):191-197.

[31]管峰,杨利国,艾君涛,等. 四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊 BMPR-IB基因型方法的建立[J]. 遗传,2005,27(4):579-583.

[32]吴磊,王丹,苏文悦,等. 利用比较基因组学开发山羊草属InDel分子标记[J]. 作物学报,2012,38(7):1334-1338.

[33]张羽,王胜宝,冯志峰,等. 陕西省水稻种质资源的香味基因检测[J]. 西北农林科技大学学报:自然科学版,2011,39(4):55-59,68.

[34]曾晓珊,杨先锋,赵正洪,等. 稻瘟病抗病基因Pia的抗性分析及精细定位[J]. 中国科学:生命科学,2011,41(1):70-77.

[35]Zhu X Y,Chen S,Yang J Y,et al. The identification of Pi50(t),a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9 multigene family[J]. Theoretical and Applied Genetics,2012,124(7):1295-1304.

[36]张帆涛,方军,孙昌辉,等. 水稻矮秆突变体dtl1的分离鉴定及其突变基因的精细定位[J]. 遗传,2012,34(1):79-86.

[37]Jiang H C,Feng Y T,Bao L,et al. Improving blast resistance of Jin 23B and its hybrid rice by marker-assisted gene pyramiding[J]. Molecular Breeding,2012,30(4):1679-1688.

[38]文绍山,高必军. 利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9(t)渗入水稻恢复系泸恢17[J]. 分子植物育种,2012,10(1):42-47.

[39]柳武革,王丰,金素娟,等. 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性[J]. 作物学报,2008,34(7):1128-1136.

[40]陈洁,胡茂林,张亮,等. 小麦持久抗病品种N. Strampelli的抗条锈病基因分析和微卫星标记[J]. 植物病理学报,2010,40(4):388-394.

[41]王金明,林秀云,刘晓梅,等. 分子标记选择水稻抗稻瘟病基因Pi40和Pib聚合体[J]. 华北农学报,2012,27(2):218-221.

[42]张羽,王胜宝,刘鑫,等. 等位基因特异扩增检测水稻抗稻瘟病基因Pi-ta[J]. 西北农业学报,2013,22(3):44-49.

[43]张羽,李新生,冯志峰,等. 陕西省有色稻资源的SSR多态性分析[J]. 植物遗传资源学报,2011,12(5):828-832.

[44]张羽,李新生,冯志峰,等. 陕西省水稻种质资源的遗传多样性分析和指纹图谱构建[J]. 西北农业学报,2011,20(12):59-65.

[45]Tacconi G,Baldassarre V,Lanzanova C,et al. Polymorphism analysis of genomic regions associated with broad-spectrum effective blast resistance genes for marker development in rice[J]. Molecular Breeding,2010,26(4):595-617.

[46]阮黎,张旭,马鑫,等. 膀胱移行细胞癌E-钙粘连素基因启动子C/A单核苷酸多态性与肿瘤复发的关系[J]. 中华试验外科杂志,2005,22(1):9-11.

[47]王伟,张斌. 少突胶质细胞瘤的诊断和分子标记物研究进展[J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2009,8(4):374-375.

[48]杨国华,王磊,宫玉艳,等. 应用分子标记对Duchenne型肌营养不良胎儿的产前基因诊断[J]. 武汉大学学报:医学版,2009,30(6):756-758,766.

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