Rock可能通过抑制PI3K/Akt通路促进缺氧诱导的心肌细胞凋亡*

董家龙， 李菊香， 孙国芳， 洪 葵

(1南昌大学第二附属医院心内科，江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006； 2赣州市南康区第一人民医院心内科，江西 赣州 341400)

Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)是新近发现的与细胞凋亡相关的激酶，是激活的caspase-3的直接裂解产物，ROCK有2个亚单位，即ROCK1和ROCK2。研究表明ROCK与心肌损伤、心肌细胞凋亡及心力衰竭有关联[1]。然而，ROCK在缺血性心肌损伤中与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路有何关系？目前尚不清楚。本研究旨在观察缺氧诱导心肌细胞凋亡过程中，ROCK1和ROCK2的变化及其与心肌PI3K之间的关系。

材 料 和 方 法

1 材料

Sprague-Dawley乳鼠(出生1～3 d) 雌雄不限，由南昌大学医学院医学实验动物科学部提供(动物合格证：医动字 021-9602)。DMEM高糖培养基及胎牛血清(FBS)购自HyClone；胰蛋白酶购自Sigma；山羊抗鼠ROCK-1Ⅰ抗、山羊抗鼠ROCK-2Ⅰ抗、兔抗鼠caspase-3Ⅰ抗、兔抗鼠p-PI3KⅠ抗、兔抗鼠PI3KⅠ抗均购自Santa Cruz；抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化试剂盒购自武汉博士德；MTS溶液购自Promega；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司

2 方法

2.1原代心肌细胞的培养及鉴定 取健康乳鼠，利用0.08%胰酶消化3次后，离心弃胰酶，接着用1%II型胶原酶消化心肌组织1～2 h，至组织消化完全，以含15% FBS的DMEM培养基(1∶1)终止消化，室温下离心5 min，收集细胞沉淀以15% FBS的DMEM培养基充分重悬，200目滤网过滤细胞悬液至培养皿，置CO2培养箱培养，经差速贴壁2 h后，加入0.1 mmol/L 5’-BrdU抑制成纤维细胞的生长，以1×109/L的细胞密度接种于35 mm的培养皿中，待心肌细胞生长接近汇和状态及呈现同步搏动时开始实验。48 h后，取有心肌细胞生长的玻片，用37 ℃ PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，加大鼠抗α-横纹肌肌动蛋白单克隆Ⅰ抗(1∶50)，于4 ℃湿盒过夜，加FITC羊抗小鼠IgG (1∶50)，孵育30 min，PBS洗2次,DAPI染核，封片剂封片，显微镜下观察。

2.2心肌细胞缺氧模型制备及各种条件培养 心肌细胞生长接近汇合状态，呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液(NaH2PO40.9 mmol/L, NaHCO36.0 mmol/L, CaCl21.8 mmol/L, MgSO41.2 mmol/L, HEPES 20 mmol/L,NaCl 98.5 mmol/L, KCl 10.0 mmol/L,乳酸钠40 mmol/L， pH 6.5)以95% N2～5% CO2预饱和1 h，将培养的细胞以模拟缺血液置换正常培养基，放入密闭气体盒中缺氧；以DMEM培养基于CO2培养箱中培养,为有氧培养。实验分为5组：常规培养组、缺氧1 h组、缺氧3 h组、缺氧6 h组和缺氧9 h组。细胞经实验干预后，检测各时点相关指标：细胞凋亡率、细胞存活率及ROCK-1、ROCK-2、活化caspase-3、p-PI3K和PI3K的表达情况。

2.3MTT法检测心肌细胞成活率 将细胞种植在96孔板中，空白调零孔只加不含细胞的培养基。实验处理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪(Labststems)测定492 nm处各孔吸光度(A)值。计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组A/对照组A)×100%。

2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率 用胰酶消化收集上述各组细胞， PBS洗涤细胞2次，再用500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，分别加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，最后用FACS Calibar流式细胞仪(Beckton Dickinson，)检测。

2.5全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH) 各组实验干预后取心肌细胞培养液 400 μL,利用全自动生化分析仪(Beckman)测定LDH活性。

2.6Western blotting 用RIPA法取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取20 μg进行SDS-PAGE分离蛋白。蛋白转印到硝酸纤维素膜上,3% BSA液4 ℃封闭过夜。膜分别用ROCK1、ROCK2、caspase-3活化片段、p-PI3K和PI3K的Ⅰ抗 (1∶200) 孵育,4 ℃ 过夜, Ⅱ抗孵育2 h,DAB显色照相。结果用LabWork 3.0 UVP软件, 以目的条带与β-actin的灰度值进行分析。

3 统计学处理

实验均重复6次。用统计学软件SPSS 12.0进行分析，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌细胞的鉴定

倒置显微镜下观察：细胞呈片状有节律的搏动，细胞致密，高度折光，细胞核小，常有1～2个核仁，有的细胞呈不规则的星形，并伸出伪足。免疫组化结果显示，抗体阳性心肌细胞胞浆内有绿色荧光，见图1。

2 心肌细胞存活率、凋亡率及上清液LDH的变化

缺氧1 h、3 h、6 h、9 h后，心肌细胞凋亡率和上清液LDH活性均显著高于对照组(P<0.01),细胞存活率均低于对照组(P<0.01),见图2、表1。

Figure 1. Cardiomyocyte identification observed by fluorescence microscopy(×100).

Figure 2. Cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia at different time points.

表1 不同时点心肌细胞存活率、凋亡率和上清液LDH活性的变化

3 心肌细胞中ROCK-1、ROCK-2蛋白表达

ROCK-1在缺氧1 h 即开始升高，在6 h 表达达高峰，在9 h开始回落，均明显高于对照组(P<0.05)。ROCK-2与在缺氧1 h即开始升高，在3～6小时表达达高峰，在9 h开始降低，均明显高于对照组(P<0.05)，与ROCK-1的表达有平行对应关系,见图3。

4 心肌细胞中PI3K和p-PI3K的表达

PI3K在不同的缺氧时点表达无明显变化，差别无统计学意义。p-PI3K蛋白的表达在缺氧1 h开始升高，在3 h左右达高峰，缺氧9 h后回落，差别有统计学意义，见图4。

Figure 3. Expression of ROCK-1 and ROCK-2 in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time.1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h；5： hypoxia 9 h. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control.

Figure 4. Expression of PI3K and p-PI3K in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time. 1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h； 5： hypo-xia 9 h. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control.

5 缺氧后心肌细胞中caspase-3蛋白表达

Caspase-3活化片段在缺氧1 h开始逐渐升高，在随后观察的时点内持续处于高表达状态，与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01),这与心肌细胞的凋亡率和培养液中的LDH的变化是一致的,见图5。

讨 论

研究表明，ROCK 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，至少有2种亚型，即ROCK1和ROCK2。ROCK参与调节细胞的一些基本功能，如收缩、游走黏附、增殖和凋亡等[2],ROCK-1和ROCK-2几乎在全身各组织都有表达，两者在心脏和血管平滑肌表达均较多，ROCK-2 mRNA在大脑和骨骼肌表达较多。静息状态下的ROCK没有酶活性，因为ROCK的激酶活性可能存在一种自我抑制的机制，即通过自身的折返使其催化中心(激酶域)覆盖，这样使得该激酶的激酶域与ATP的亲和力受到抑制或使得其下游区域不能与底物结合而不被激活。ROCK的活性受细胞外信号和一些胞浆蛋白的调节,ROCK接受Rho传递的活化信号，发生多个氨基酸位点的磷酸化而激活，并介导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应。心力衰竭和冠心病发病过程中伴随着心肌细胞凋亡[3]，近年来，认为ROCK与心肌细胞凋亡有关系[4]。研究发现在心肌细胞中，ROCK1可以被caspase-3激活，ROCK1是活化的caspase-3的直接裂解底物，而激活的ROCK1又可以反馈激活caspase-3，如此形成恶性循环[5]。

Figure 5. The expression of cleaved caspase-3 in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time. 1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h； 5： hypoxia 9 h. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control.

本研究发现，缺氧损伤能引起心肌细胞凋亡增加及引起caspase-3活化，缺氧早期可以引起磷酸化的PI3K蛋白表达增加，这可能是心肌细胞抗凋亡的的保护机制，在继续缺氧过程中磷酸化PI3K开始下降至基本消失。与此同时，缺氧也可以引起ROCK-1和ROCK-2蛋白增加，并且在缺氧6 h左右表达达高峰，心肌细胞凋亡率也随着缺氧时间而逐渐增加，p-PI3K在ROCK表达达高峰时开始回落， 提示ROCKs的激活可能抑制了p-PI3K的表达，进而促进了缺氧心肌细胞的凋亡。

PI3K/Akt信号通路是近年来发现参与细胞增殖调控的重要信号通路，近来研究资料表明PI3K/Akt通路是许多生命活动中关键的信号分子，PI3K/Akt介导的信号通路调节细胞的分裂、分化和凋亡等活动。研究发现PI3K/Akt信号途径在缺血预适应、缺血再灌注损伤中被激活，进而抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。研究表明PTEN是一种磷酸(酯)酶，是新近证实的ROCK的一种底物,其可以使磷酸肌醇底物去磷酸化，在细胞内信号转导中起了很重要的作用，尤其在PI3K/Akt信号通路中，它是PI3K上游区域的一个负性调节蛋白，与细胞生长的调节，蛋白质的合成，转录子的调节及细胞存活有关。PTEN可以通过ROCK而磷酸化，进而被激活。有文献表明ROCK抑制剂保护心脏是通过抗细胞凋亡的作用，这是ROCK抑制剂减弱了缺血再灌注引起的Bcl-2下调及通过激活PI3K/Akt/eNOS途径来保护心脏，这种保护作用可以被PI3K抑制剂LY294002完全阻断；在心肌的局部缺血/再灌注损伤中，心肌中RhoA的表达及其后ROCK活性均有增加,在缺血再灌注早期给予ROCK抑制剂可以显著减少SD大鼠心肌梗塞的面积及心肌细胞凋亡率[6]。综上所述， ROCKs可能参与了缺氧致心肌细胞凋亡的过程，其机制可能是通过抑制p-PI3K信号途径进而促进缺氧心肌细胞凋亡；ROCK可能通过激活caspase-3引起缺氧心肌细胞凋亡。

[参 考 文 献]

[1] Fukui S, Fukumoto Y, Suzuki J, et al. Long-term inhibition of Rho-kinase ameliorates diastolic heart failure in hypertensive rats[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2008， 51(3): 317-326.

[2] Okamoto R, Li Y, Noma K, et al. FHL2 prevents cardiac hypertrophy in mice with cardiac-specific deletion of ROCK2[J]. FASEB J, 2013， 27(4):1439-1449.

[3] 米亚非，李小鹰，江 健，等. rAAV-1SERCA2a转染改善心力衰竭犬心功能及其机制探讨[J]. 中国病理生理杂志, 2014， 30(2): 208-213.

[4] Surma M, Wei L, Shi J. Rho kinase as a therapeutic target in cardiovascular disease[J]. Future Cardiol, 2011,7(5):657-671.

[5] Chang J, Xie M, Shah VR, et al. Activation of Rho-associated coiled-coil protein kinase 1 (ROCK-1) by caspase-3 cleavage plays an essential role in cardiac myocyte apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(39):14495-14500.

[6] Jiang ZH, Zhang TT, Zhang JF. Protective effects of fasudil hydrochloride post-conditioning on acute myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Cardiol J, 2013, 20(2): 197-202.