大豆蛋白的酶水解及类蛋白反应对其抗氧化活性的影响

张向挺（东北农业大学理学院应用化学系 黑龙江省哈尔滨市150030）

前言：

大豆蛋白的类蛋白反映有利于催化蛋白质酶水解的逆过程，其原理就是由较低的分子质量的肽所形成一种类似与蛋白质的混合物体，在实验的反应过程中受到水解作用、缩合作用、转肽作用以及物理聚集作用的影响，而最终形成新结构的肽，这种转化过程影响了其生物学的活性。化学研究者通过精心钻研后得出结论：醋蛋白的水解物的类蛋白反应能对其抗氧化反应起到推动作用。为了验证这项结论，本文将通过实验的方法，深入研究大豆蛋白的酶水解以及随后的类蛋白反应对其抗氧化活性的影响。

一、材料和方法

1.材料与试剂

在做这项实验之前，共准备了材料：大豆分离蛋白、蛋白酶、二苯基、三硝基苯肼、连氮、铁氰化钾、邻二氮菲、邻苯三酚、其他试剂以及蒸馏水。

2.仪器与设备

为了更加准确分析实验结果，还需要准备紫外—可见分光光度计、自动凯氏定氮仪、高速冷冻离心机、真空冷冻干燥机、全温振荡培养箱、精密pH计、分析天平、微型旋涡混合器远红外恒温干燥箱、电热恒温水浴锅等设备。

3.实验方法

（1）碱性蛋白酶大豆蛋白水解物

首先需要配制出来浓度为100 mg/ml的大豆分离蛋白的液体，并通过2 mol/NaOH的溶液使之调整到pH值到8左右，并添加1000 U/g的蛋白酶，在50℃的恒温水浴中进行酶解实验。根据不同的水解时间分别取出20 ml的样品，再将浴中的水迅速升温到100℃加热15分钟，待到室温冷却后调节pH值到4.5并分离出上清液。通过这些蛋清液测试出水解度[1]。根据测试出来的结果，确定出合适的水解时间，并放大刚刚分解出的大豆蛋白水解物，冷冻干燥后备用。

（2）三硝基苯肼自由基的清除能力测试

这项实验的具体步骤为：提取三硝基苯肼0.0079 g，用无水乙醇对其加以溶解，最后定容到100 ml，所配制出的溶液就是乙醇溶液，放到棕色瓶内并在不受阳光照射的条件下保存。同时提取1 ml的三硝基苯肼溶液和2 ml的样品溶液加以混合，同时放置在暗处保存，让其反应30分钟，根据结果测定其吸光度，并通过无水乙醇来进行空白试验。

（3）连氮清除能力测试

在此项实验中，测定的连氮溶液要通过连氮溶液和硫酸钾溶液的反映当中产生，此混合物要在使用前在暗处的环境下保存12-16个小时。在测评的过程中，通过连氮溶液测试吸光度，为了让测试结果更加合理，需要连续测试三次。

（4）还原力测试

在这项实验中，需要提取5 mg/ml的样品溶液1 ml将其与2.5 ml的磷酸钠溶液与2.5 ml的铁氰化钾溶液混合，在30分钟的50℃恒温中反应，反应之后迅速冷却后加入2.5 ml的10%三氯乙酸溶液，提取2.5 ml的上清液，加入2.5 ml的蒸馏水和0.5 ml的氯化铁溶液，均匀进行混合。在反应10分钟后，测定吸光度，并根据实验的结果来测定其还原力，吸光度越大表明了还原能力越强。

二、结果与分析

1.大豆蛋白水解物制备

根据实验结果表明，大豆蛋白的水解物的抗氧化性会随着水解度的增大而增大，水解时间越长，则水解度越高，对连氮的清除率也就越明显。但如果水解时间延长的话，连氮清除率却没有显著性的提高。

2.类蛋白反应条件的优化

利用蛋白酶等成分对所制备的大豆蛋白的水解物进行类蛋白反应，设定一个反应的时间进行实验，并根据实际的需要来分析出酶添加量、底物浓度和温度对修饰产物游离氨基减少量的影响。

最后以类蛋白反应后的产物游离氨基减少量当成一个指标，利用方程式求解的方式，得到最终的类蛋白反应最优条件[2]。

3.得出实验结论

通过该实验，可以看出大豆蛋白的水解物、修饰产物的抗氧化活性要远远高于大豆蛋白本身，类蛋白反应也能显著提高大豆蛋白水解物的修饰产物中的抗氧化活性。因此可以得出实验结论：大豆蛋白的蛋白酶水解、类蛋白的反应修饰，能够应用与制备高活性的大豆蛋白抗氧化肽的研究。

三、抗氧化活性肽的作用机理

自由基是独立存在的一种化学形式，化学性质及其活泼。自由基在通常情况下可以攻击生命体内的大分子物质和细胞壁，造成机体本身的多种损伤，加速机体的老化。当处于正常的生理条件下，机体中的自由基可以达到一个产生与自动清除相互平衡的状态下，但一旦机体处于不良的状态，并随着人类年龄的增长，机体中的自由基就会大量生产并且清楚缓慢[3]。针对这样的现象，人们研制出一种人为的自由基清除剂，又被称之为抗氧化剂，能够有效清除机体当中多余的自由基，减轻其对机体的损害。

根据目前的实际情况来看，已有的抗氧化剂一般条件下会通过五种途径来达到抗氧化的目的：抑制脂质过氧化反应、直接清除活性氧自由基、清除氧、螯合金属离子以及激活体内本身自带的抗氧化防御系统。抗氧化剂主要来源于蛋白酶的水分解物，其可以有效抑制机体内自由基的过量积累，对清除体内的自由基有着十分显著的功效。

结论

人类许多的慢性病以及衰老的现象发生均来源于人机体内的自由基失衡，积累了过量的自由基会对人体细胞造成严重的损伤。为了改善这种现象，人们通过蛋白酶的抗氧化剂来帮助人们维持身体的自由基平衡。本文通过实验研究，分析出蛋白酶水解和类蛋白反应对于其抗氧化活性的影响，并根据此实验结果完善抗氧化剂的研制，以便于让人类的机体更加健康，有效防止慢性疾病的产生。

[1]王鑫，江连洲，吴瑕，田瑞红.碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白及其抗氧化活性的研究[J].东北农业大学学报，2011，（11）:24-31.

[2]宋佳天，赵新淮.大豆蛋白的酶水解及类蛋白反应对其抗氧化活性的影响[J].食品科学，2012，（01）:115-119.

[3]杨锋，陈锦屏，阳显莹.醋蛋水解物的类蛋白反应及对抗氧化活性的影响[J].食品工业科技，2012，（08）:152-155.