八聚精氨酸修饰的载ASODN脂质体的构建及体外评价

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)是根据核酸杂交原理设计，能够选择性抑制特定基因表达的核苷酸序列[1].ASODN以其安全性高，设计简便，合成容易，能特异性地作用于异常基因的特点，已在基因治疗领域取得飞速发展.然而，ASODN不能穿过生物膜进入靶部位与靶分子结合，限制了它的临床应用.如何有效地将基因药物传递至细胞内已成为基因治疗广泛应用急需解决的瓶颈问题之一[2].非病毒类载体由于具有ASODN携载率高、免疫原性低、易大量制备等优点，已成为近年来ASODN载体研究开发的主要方向之一.脂质体具有良好的生物相容性﹑低毒性以及表面可修饰的特性，近年来已成为非病毒基因载体的首选[3].与病毒载体相比，脂质体的转染效率明显偏低.为了提高脂质体的细胞摄取效率，常对其表面进行修饰.八聚精氨酸(R8)是在TAT49-57寡肽的基础上，筛选出的具有较强穿膜能力的膜活性肽，经其修饰的载体入胞效率可显著提高[4].基于以上研究成果，在普通脂质体中插入硬脂酰-R8，并对其理化性质和入胞效率进行评价，以期获得高效低毒的非病毒基因载体.

1 仪器与材料

1.1 仪 器

REV-52CS型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；ELWD0.3 T1-SNCP三目倒置相差显微镜(Nikon)；SpectraMax M2e多功能酶标仪(美国分子仪器公司)；SHB-IIIA循环水式多用真空泵(河南省太康科教器材厂)；DelsaNano激光粒度测定仪(Beckman公司)；JY92超声细胞粉碎机(宁波新芝科技研究所)；GL-88D涡旋混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；3111二氧化碳恒温培养箱(Thermo ELECTRON COPOERATION).

1.2 材 料

大豆卵磷脂S100(德国Lipoid公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(吉诺生物医药技术有限公司)；胆固醇(国药集团化学试剂有限公司)；MTT(美国Sigma公司)；胎牛血清(吉诺生物医药技术有限公司)；胰酶(吉诺生物医药技术有限公司)；DMEM(含双抗，吉诺生物医药技术有限公司)；肝癌细胞(HepG-2)和肺癌细胞(A549)(浙江工业大学药理实验室提供)；口腔上皮癌细胞(KB)(中科院上海细胞所)；FITC-反义寡核苷酸(ASODN，序列为FITC-GGAGCGCGCGGCATCGCGG，上海生工技术服务有限公司)；硬脂酰八聚精氨酸(R8，上海生工技术服务有限公司)；其他均为分析纯试剂.

2 实验方法

2.1 硬脂酰-R8修饰脂质体的制备

称取大豆磷脂100 mg和胆固醇50 mg，加10 mL氯仿溶解，于旋转蒸发仪上减压蒸馏成膜(温度25 ℃，真空度-0.95 MPa).加入10 mL超纯水剧烈振摇使膜脱落，在40 ℃下水化2 h，探头超声(工作3 s，间歇3 s，功率400 W，数量200次)，0.45 μm微孔滤膜过滤，稀释至10 mL即得磷脂质量浓度为10 mg/mL的空白脂质体(NLip)[5-6].

硬脂酰八聚精氨酸用超纯水溶解，并稀释成一系列的浓度，分别与空白脂质体等体积混合，并在45 ℃下孵育1 h，即得R8浓度不同的R8-Lip.

2.2 粒径和Zeta电位的测定

NLip和R8-Lip用PBS稀释成2.5 mg/mL，用粒度测定仪测定其粒径和Zeta电位.检测条件和参数：温度25 ℃，平衡时间2 min，介质折光率为1.33，粘度为0.895 mPas.

2.3 R8-Lip/ASODN的结合率

采用琼脂糖凝胶阻滞试验来判断R8-Lip/ASODN复合物的形成情况[7].取适当质量浓度的R8-Lip与0.100 mg/mL ASODN等体积混合并且旋涡震荡混匀，使其中+/-电荷比(以ASODN中的P(-)和R8中的N(+)计)分别为1∶2，1∶1，4∶1，8∶1，16∶1，32∶1，室温孵育30 min，使R8-Lip与ASODN完全结合.取15 μL ASODN/R8-Lip复合物与3 μL 6×DNA电泳加样缓冲液混匀，从中取15 μL加于上样孔中，以相同浓度的游离ASODN作对照.电泳条件：琼脂糖凝胶的质量分数为0.8%，电压80 mV，时间10 min，显色剂为溴化乙锭.置于紫外灯下观察，并用凝胶成像系统拍照保存.

2.4 R8-Lip的细胞毒性

用溴化四氮唑比色法(MTT Assay)[8-9]评估R8-Lip的细胞毒性.将HepG-2细胞消化后，用含10%血清的DMEM培养液稀释成5×104个/mL的细胞悬液，并以100 μL/孔接种于96孔板中,37 ℃和5% CO2培养箱培养过夜.当细胞贴壁完全并且处于对数生长期，弃去旧的培养液，用冷的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次，然后加入一定量的R8-Lip和不含血清的DMEM培养基，使得R8的终质量浓度分别为0,0.5,2,5,10,20,40 μg/mL，Lip的最终质量浓度为20 μg/mL.最终每孔总体积为150 μL，平行设置6个复孔.培养5h后，弃去旧培养液，按100 μL/孔的量加入1 mg/mL MTT溶液，继续培养.4 h后，吸去MTT培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振摇10 min使结晶溶解完全，设调零孔(每孔150 μL DMSO)，以没加脂质体复合物孔为对照，测定570 nm处的吸光度.在KB细胞和A549细胞中以相同方法考察载体毒性.细胞存活率计算公式为

其中:A570(样品)为R8浓度不同的样品孔的吸光度；A570(对照)为对照孔的吸光度.

2.5 R8-Lip对细胞摄取ASODN的促进作用

将HepG-2细胞消化后，用含10%血清的DMEM培养液稀释成5×104个/mL的细胞悬液，并以200 μL/孔接种于96孔板中,37 ℃和5% CO2培养箱培养过夜.当细胞贴壁完全并且处于对数生长期，弃去旧的培养液，用冷的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次.取适量R8-Lip/ASODN复合物加入培养孔中，补充不含血清的DMEM培养基使每孔终体积为150 μL，ASODN的最终质量浓度为1 μg/mL，R8-Lip的最终质量浓度(以R8计)分别为0.3,0.6,2.4,4.8,9.6 μg/mL，即R8-Lip/ASODN复合物中+/-分别为1∶2，1∶1，4∶1，8∶1，16∶1，每个浓度设三个复孔，同时以lipofectamine 2000组和游离ASODN组为对照.37 ℃和5%的CO2培养箱中培养5 h，然后弃去培养液，用PBS清洗3遍，置于荧光显微镜下观察并拍照[10].以相同方法考察KB和A549细胞株中载体对ASODN摄取的促进作用.

3 结果与讨论

3.1 粒径和zeta电位

从表1和图1中可以看出:NLip和R8-Lip的粒径及其分布差异不大，该结果证明脂质体经R8修辞后，基本不改变其粒径和分布.NLip和R8-Lip的zeta电位存在明显的差别，NLip电位为-10.24 mV，而R8-Lip电位为+38.69 mV.结果表明：带正电的R8和带负电的NLip通过孵育，使得R8成功地插到磷脂双分子层中，使得普通脂质体表面的电性发生翻转，从而具备了作为基因载体的潜力.

表1 NLip和R8-Lip的粒径和zeta电位

图1 NLip和R8-Lip的粒径及其分布

3.2 R8-Lip/ASODN的结合率

图2为不同+/-时的凝胶阻滞实验结果，从左到右依次是ASODN；R8-Lip/ASODN复合物+/-=2∶1，1∶1，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32.从图2中可以看出：R8的量很少时，ASODN被部分阻滞在上样孔；随着R8量的增加，ASODN的阻滞率明显增加；当+/-超过4∶1时，ASODN完全被阻滞，表明在该+/-时，ASODN已与R8-Lip完全结合成带正电的复合物，停留在上样口.

图2 琼脂糖凝胶电泳图

3.3 R8-Lip的细胞毒性

图3为R8-Lip和NLip在HepG-2，KB和A549肿瘤细胞中MTT实验结果，从图3中可以看出：当NLip为20 μg/mL时，几乎无细胞毒性；R8-Lip在三种细胞系中毒性随R8质量浓度的增加而增加.当R8的质量浓度为20 μg/mL时，三种细胞的存活率均低于70%，这说明该质量浓度下三种细胞均存在明显的毒性.当R8的质量浓度为10 μg/mL时，HepG-2细胞的存活率超高80%，KB和A549细胞的存活率高于75%.因此，当R8-Lip中R8的质量浓度不超高10 μg/mL时，可用于HepG-2，KB和A549细胞的转染.

3.4 R8-Lip对ASODN细胞摄取的促进作用

图4为细胞摄取图，从上到下依次是KB，HepG-2和A549；从左到右依次是NLip，R8-LiP(+/-=16∶1)和Lipfectamine 2000.实验结果显示：游离的ASODN很难进入细胞.在KB，HepG-2和A549三种细胞株中，NLip对ASODN的摄取几乎无促进作用.R8-Lip对ASODN细胞摄取的促进作用与R8的质量浓度有关，当R8的质量浓度由0.3 μg/mL增加到9.6 μg/mL(+/-由1∶2增加到16∶1)，细胞内荧光强度逐渐增加(图中未列出).当R8-Lip/ASODN复合物中+/-=16∶1时，R8对ASODN摄取的促进作用强于市售的转染试剂Lipfectamine 2000,如图4(a，c，e)荧光强度要分别高于图4(b，d，f).

图3 NLip和R8-Lip的细胞毒性

4 结 论

普通脂质体表面显电负性，ASODN负载率不高，转染效率低，故不能直接用作ASODN的载体[11].本实验用R8对普通脂质体进行修辞，不改变其粒径，却能改变其电荷特性，使其具备阳离子脂质体的特征，能够与ASODN形成复合物.R8是一段具有膜活性的多肽，经其修饰后的脂质体能够作为ASODN的载体，当+/-=16∶1时，体外摄取效率高于市售的转染试剂Lipfectamine 2000.R8-Lip细胞毒性具有明显的浓度依赖性，在安全的浓度范围内，其促进细胞摄取的能力依然很强.因此，R8-Lip作为ASODN的载体，具备了高效低毒的优势，值得进一步深入的研究.

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