覆盆子药材质量标准研究*

★ 郭卿 付辉政 周国平 杨毅生 钟瑞建

(1.江西省食品药品检验所，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心 江西 南昌 330029；2.江西中医药大学 江西 南昌 330004)

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子RubuschingiiHu的干燥果实，别名种田泡、树莓、牛奶母、大号角公，主要分布于浙江、江西、安徽及贵州等地。具有补肾、固精、明目之功效，用于肾虚遗尿、小便频数、阳痿早泄、遗精漏精等症的治疗[1,2]。覆盆子所含化学成分较复杂，迄今已报道的从覆盆子果实和叶中分离得到的化学成分包括酚酸类、黄酮类、生物碱类、甾醇类、萜类、香豆素类、长链脂肪族类、有机酸等[3]。

覆盆子为《中国药典》2010版一部收载品种，标准中仅有性状和粉末鉴别，为了更好地控制覆盆子药材的质量，笔者对覆盆子70%乙醇提物化学成分进行了系统的研究，从覆盆子药材中分离鉴定了10个成分，其中鞣花酸、椴树苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷为覆盆子中的主要特征成分[4-6]。覆盆子为2015版《中国药典》一部起草品种，基于前期对覆盆子化学成分研究基础，对不同产地的10批覆盆子药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物进行了研究、采用薄层色谱法及HPLC法进行了定性、定量研究。为覆盆子的质量标准提高奠定了基础。

1 仪器与试药

岛津LC 2010高效液相色谱：四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外可变波长检测器，SHIMADZU Lcsolution色谱工作站。BS110S十万分之一天平(Sartoris )。电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈饮用纯净水，其他试剂均为分析纯。

鞣花酸对照品、椴树苷对照品、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品为本实验室自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等确证了它们的结构，纯度经HPLC检测大于98%。

覆盆子药材10批为本课题组收集，由江西省食品药品检验所袁桂平中药师鉴定为覆盆子(RubuschingiiHu)，标本存于江西省食品药品检验所科研室。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 鞣花酸薄层色谱鉴别

取2.3.3项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取鞣花酸对照品，加甲醇分别制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上对照品溶液2μL，供试品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层析上，以氯仿∶甲醇∶甲酸(4∶1∶1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，见图1。

1.为鞣花酸对照品；2.3.4.为供试品

2.1.2 椴树苷薄层色谱鉴别

《结婚十年》是苏青最具代表性的一部带有自传体性质的长篇小说。书中主要描写了女主人公苏怀青与丈夫徐崇贤十年以来的平淡而又辛酸的婚姻生活，揭示了一个渴望追求新生活的都市女性，在新旧思想交替的战争年代与男权压抑之下的漫长而又曲折的心路历程。

取2.3.3项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取椴树苷对照品，加甲醇分别制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上对照品溶液2μL，供试品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层析上，以乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸(90∶4∶4∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热5min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图2。

1.为椴树苷对照品；2.3.4.为供试品

2.2 水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的测定 水分测定按《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H第一法水分测定法中的第一法烘干法测定；总灰分、酸不溶性灰分测定按《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K灰分测定法；水溶性浸出物按《中国药典》2010年版一部附录Ⅹ A项下的热浸法测定[7]。10批药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的测定结果见表1。

表1 覆盆子药材中水分、灰分及浸出物测定结果(%)

2.3 山柰酚-3-O-芸香糖苷的HPLC含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Welch C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)；流速:1.0mL/min；检测波长:344nm；柱温:30℃；进样量:10μL。在上述色谱条件下，覆盆子中山柰酚-3-O-芸香糖苷与其他组分的色谱峰分离度良好。色谱图见图3。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，加甲醇制成1mL含80μg的溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水20mL使溶解，用石油醚提取3次，每次20mL，弃去石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图3 山柰酚-3-O-芸香糖苷(A)和覆盆子药材(B)的HPLC图

2.3.4 线性关系的考察 取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，分别置50mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容，摇匀，得山柰酚-3-O-芸香糖苷(0.0789mg/mL)的对照品溶液，分别吸取1，2，4，6，8，10，20μL，按上述色谱条件测定峰面积。以山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量C(μg)为横坐标，相应色谱峰面积积分值A为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为A=1×106C-9996(r=0.9999)。山柰酚-3-O-芸香糖苷在0.0789～1.1835μg之间成良好的线性。

2.3.6 重现性试验 取同一批覆盆子粉末(过4号筛)6份，每份约1.0g，精密称定，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，山柰酚-3-O-芸香糖苷的平均含量为0.775mg/g，RSD为1.6%，表明该方法有良好的重现性。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定，测得山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD(n=6)为1.36%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.8 回收率试验 采用加样回收法，取已知含量的覆盆子药材粉末(过4号筛)6份，每份约0.5g，每份精密加入含山柰酚-3-O-芸香糖苷(0.0078 mg/mL)的对照品溶液50mL，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，计算回收率。结果山柰酚-3-O-芸香糖苷的平均回收率(n=6)为101.9%，RSD为0.7%。

2.3.9 耐用性试验 取同一批覆盆子药材粉末(过4号筛)约1.0 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别用A：Welch C18(250 mm×4.6mm，5μm)、B：Promosi C18(250mm×4.6mm，5μm)、C：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)三种品牌的色谱柱按正文中的色谱条件对其进行测定，结果无明显差别。

2.3.10 样品测定 分别取不同产地的10批覆盆子药材，每个样品取3份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，在上述色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量，测定结果见表2。

表2 覆盆子中山柰酚-3-O-芸香糖苷的测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 TLC鉴别 在鞣花酸薄层色谱鉴别中，通过对比不同比例的氯仿∶甲醇∶甲酸(4∶1∶1.5；5∶1∶1)和甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(4∶1∶1.5；5∶1∶1)等不同展开剂，结果表明氯仿∶甲醇∶甲酸(4∶1∶1.5)系统能展开清晰斑点且能完全分开。在椴树苷薄层色谱鉴别中，通过比较不同比例的正丁醇∶甲醇∶水∶甲酸(80∶5∶5∶0.5；90∶4∶4∶0.5)和乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸(80∶5∶5∶0.5；90∶4∶4∶0.5)等不同展开剂，结果表明乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸(90∶4∶4∶0.5)展开椴树苷，斑点清晰且能完全分开，重复性好。

3.2 测定波长的选择 取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，用甲醇制成适当的浓度，以甲醇为空白，在400～200nm波长范围内进行光谱扫描，结果山柰酚-3-O-芸香糖苷在263和350nm波长处有最大吸收，由于344nm杂峰对目标峰干扰少且稳定，故选择344nm作为检测波长。

3.3 提取方法的选择 比较了甲醇加热回流提取，甲醇超声提取2种提取法。结果表明加热回流提取法提取效率大于超声提取法。实验过程中比较了提取时间(30，60，90min)和甲醇浓度(30%，50%，70%，90%，100%)，结果表明提取60min可将山柰酚-3-O-芸香糖苷完全提取，甲醇浓度为70%时，提取效率稍高于其他比例。

3.4 石油醚和水饱和正丁醇萃取次数的选择 对其石油醚萃取次数进行了考察，结果用石油醚提取不能将山柰酚-3-O-芸香糖苷提取出来，当用石油醚提取3次后，石油醚提取液蒸干后，基本没有内容物，故选择用石油醚提取3次。对其水饱和正丁醇提取次数进行了考察，结果用水饱和正丁醇提取第4次时已提取完毕，故选择用水饱和正丁醇提取3次。

3.5 色谱条件的优化 本实验通过摸索乙腈与磷酸水溶液，甲醇与磷酸水溶液按一定比例混合作为流动相，考察其分离度，结果以乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃的色谱条件下药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷与其他共存组分峰能达到良好的分离。

本实验建立了覆盆子药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的HPLC含量测定方法，并对其进行了TLC定性鉴别及水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物检测，该方法操作简便、结果可靠、重复性好。

[1]江西省卫生厅.江西省中药材标准(1996年版)[M].南昌：江西科学技术出版社，1996：130-131.

[2]江苏新医学院.中药大辞典(1977年版)[M].上海：上海人民出版社，1977:1 261.

[3]程丹,李洁,周斌,郑鹏武.覆盆子化学成分与药理作用研究进展[J].中药材,2012,35(11):1 873-1 876.

[4]柴伟,王祝举,唐力英,等.HPLC测定覆盆子中椴树苷的含量[J].中国中药杂志,2009,34(19):2 534-2 535.

[5]孙萍,李艳,杨秀菊.覆盆子果总黄酮的微波提取及含量测定[J].数理医药学杂志,2003,16(1):85-86.

[6]程丽珍,张玲,谢晓梅.超高效液相色谱法同时测定覆盆子中3种黄酮成分的含量[J].安徽中医学院学报,2012,31(5):75-77.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2010.