四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型比较*

★ 徐彭 谈伟锋 刘波* 谢珍 曹怡 周年

(江西中医药大学药学院 江西 南昌 330004)

复制合适的稳定的肝损伤动物模型是寻找肝损伤治疗药物的前提。目前对于肝损伤模型主要由化学性、免疫性、药物、酒精等物质诱导产生[1,2]。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)是常见的外源性化合物[3]，能产生肝损伤并被用于研究药物的防治作用。兰凤英等[4]以0.2%的CCl4油溶液复制小鼠急性肝损伤模型，发现郁金能抗CCl4致小鼠急性肝损伤的作用。宁康健等[5]采用0.1% CCl4油溶液复制小鼠肝损伤模型研究黄芩苷对小鼠肝损伤的保护研究。此外，也有学者以不同浓度的CCl4复制出小鼠肝损伤模型用于保肝药的研究[6,7]。但是，由于复制动物模型所用CCl4油溶液的浓度、药方式和给药时间不同,导致小鼠肝损伤类型不同，表现多种多样，缺乏稳定性。因此，选择稳定、有效的CCl4致小鼠肝损伤模型的复制方法是开展实验研究的重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠120只，雌雄各半，SPF级，体重18～22g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证编号：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 药物与试剂 AST、ALT检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20120719和20120719)；CCl4溶液(汕头市陇西化工厂有限公司，许可证编号：XK13-201-00153)；金龙鱼特香花生油(江西省南昌市新建县欧尚超市，商品编号1005703882)。

1.1.3 实验仪器 UV-2102C型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)，超声波清洗器SK5200LH(上海科导)，BS124S分析天平 (Sartorius)，YP202N电子天平(上海精密仪器有限公司)，手动转轮切片机(Leica)，H-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腹腔注射给药诱导小鼠肝损伤 健康昆明小鼠40只，随机分成4组，即正常组、CCl4高剂量组、CCl4中剂量组、CCl4低剂量组。采用腹腔注射的方式，分别注射生理盐水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的1% CCl4油溶液(油为食用植物油)，给药24 h。

1.2.2 皮下注射给药诱导小鼠肝损伤 健康昆明小鼠40只，随机分成4组，即正常组、CCl4高剂量组、CCl4中剂量组、CCl4低剂量组。采用皮下注射的方式，分别注射生理盐水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的0.2% CCl4油溶液(油为食用植物油)，隔天给药，连续给药14 d。

1.2.3 灌胃给药诱导小鼠肝损伤 实验取雌雄各半、体重18～22 g健康昆明小鼠40只，饲养一周后，随机分成雌雄各半4组，即正常组、CCl4高剂量组、CCl4中剂量组、CCl4低剂量组。采用灌胃给药方式，分别灌胃蒸馏水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的0.2% CCl4油溶液(油为食用植物油)，每隔48小时给药，连续给药90 d。

1.2.4 血清AST、ALT活性检测 分别在24 h、14 d、90 d时，眼眶取血，并离心获取血清，采用比色法测定谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)(所有步骤均按照试剂盒说明书进行)。

1.2.5 肝组织病理学检查 分别在24 h、14 d、90 d时，脱颈处死动物，取肝脏，并以10%多聚甲醛固定肝脏组织，常规石蜡包埋，经过80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇脱水透明后进行石蜡包埋，常规切片，片厚4μm。铺片和烘片后用二甲苯脱蜡，脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固。二甲苯浸泡2次各5min，然后逐层乙醇复水：无水乙醇I 2min，无水乙醇II 2min，95%乙醇I 2min，95%乙醇II 2min，80%乙醇2min，75%乙醇2min 。蒸馏水洗1min接着苏木素染色5min然后自来水轻轻冲洗1min反蓝，1%盐酸乙醇分化30s，自来水浸泡7min；放置伊红液中2min，无水乙醇I2min，无水乙醇II2min，二甲苯I4min，二甲苯II4min。待切片干后，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察各组小鼠肝脏病理学形态变化。

2 结果

2.1 腹腔注射诱导急性肝损伤动物模型的复制

表1 不同浓度的CCl4腹腔注射对肝组织操作的影响

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01，以下均同。

表2 不同浓度的CCl4皮下注射对肝组织损伤的影响

由表1可见，不同浓度的CCl4腹腔注射均可产生急性肝损伤，使血清ALT明显升高，但只有高剂量才能升高AST。

2.2 皮下注射诱导亚急性肝损伤动物模型的复制

由表2可见，不同浓度的CCl4皮下注射均可产生亚急性肝损伤，只有CCl4中剂量不仅可使血清ALT明显升高，还能升高AST。

2.3 灌胃给药诱导慢性肝损伤动物模型的复制

表3 不同浓度的CCl4灌胃对肝组织损伤的影响

表3显示，不同浓度的CCl4灌胃给药均可产生肝损伤，CCl4各剂量不仅可使血清ALT明显升高，还能升高AST，作用稳定，且呈浓度依赖性。

2.4 CCl4不同给药途径对肝组织形态的影响

图1显示，腹腔注射CCl4高、中、低剂量均能造成小鼠肝损伤，肝损伤较为严重，损伤区域呈带状坏死并伴有严重的脂肪性病变，且各组间区别不明显。皮下注射CCl4高、中、低剂量均能造成小鼠肝损伤，其中CCl4高剂量造成的小鼠肝损伤较为严重，损伤区域成带状坏死并伴脂肪性病变， CCl4中、低剂量造成小鼠肝损伤与CCl4高剂量相比带状坏死较少，多呈小区域肝细胞坏死并伴随炎细胞浸润，坏死区域有较多的肝细胞细胞核破裂溶解。灌胃CCl4高、中、低剂量也能造成小鼠肝损伤，CCl4高、中、低剂量诱导肝损伤呈肝细胞变性，其中高剂量诱导的肝损伤区域有大量的肝细胞坏死并伴肝细胞脂肪样变性，损伤区域有大量的炎性细胞浸润，周围的肝细胞细胞核固缩、溶解。中剂量诱导的肝损伤区域有极少量的肝细胞坏死并伴有肝细胞脂肪样变性，损伤区域有炎性细胞浸润，周围的肝细胞核固缩，溶解。低剂量诱导的肝损伤程度较轻，仅有部分区域的肝细胞细胞核固缩、溶解伴有少量的炎性细胞浸润。

A.正常组；B.腹腔注射CCl4高剂量组；C.腹腔注射CCl4中剂量组；D.腹腔注射CCl4低剂量组；E.皮下注射CCl4高剂量组；F.皮下注射CCl4中剂量组；G.皮下注射CCl4低剂量组；H.灌胃CCl4高剂量组；I.灌胃CCl4中剂量组；J.灌胃CCl4低剂量组

3 讨论

CCl4引起肝细胞损伤时，破坏膜的结构，肝细胞内的多种酶可透过肝细胞膜到肝窦状隙进入血液，使血中的多种酶活性增高[7]。ALT与AST主要分布在肝脏的肝细胞内。肝细胞坏死时ALT和AST活性升高。其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，是目前最常用的肝功能指标[8]。AST和ALT在肝细胞分布不同，其中ALT主要分布在肝细胞浆，AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中。急性肝炎和慢性肝炎轻型，虽有肝细胞的损伤，肝细胞的线粒体仍保持完整，故释放入血的只有存在于肝细胞浆内的ALT，主要表现为ALT升高。重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，或肝硬化、肝癌，肝细胞线粒体遭到严重破坏，AST从线粒体和胞浆内释出，表现AST活性明显升高[9，10]。本研究显示急性、亚急性CCl4肝损伤组的ALT与正常组相比存在显著性差异，而AST与正常组相比并无显著性差异。说明CCl4急性和亚急性组的肝细胞虽然受到严重破坏，但是肝细胞中的线粒体并没有受到严重的破坏。而CCl4所致慢性肝损伤模型不仅能升高ALT,并且升高AST,浓度存在依赖性，说明肝细胞不仅细胞膜被破坏，肝细胞中的线粒体也受到了破坏，造模相对稳定，因此长时间灌胃CCl4最有利于小鼠慢性肝损伤模型的复制。

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