HPLC法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量

何广吉+吴坚毅

[摘要] 目的 探讨高效液相色谱法（HPLC）测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量。 方法 采用HPLC测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱，以甲醇-冰醋酸-水（50∶1∶50）为流动相；流速：1.0 ml/min，检测波长为278 nm，色谱柱温度为30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应≥2500。用该方法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量进行分析。 结果 黄芩苷在278 nm波长，每毫升含50～500 μg溶液范围检测峰面积存在非常好的重现性，稳定性好，平均回收率为96.02%，相对标准偏差（RSD）=0.29%（n=6）。 结论 高效液相色谱法检测黄芩苷含量的方法简便、准确、重现性好，可应用于芩霍双清饮中黄芩苷的定量测定，作为控制药品质量标准加以推广及应用。

[关键词] 高效液相色谱法；黄芩苷；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0010-04

中成药芩霍双清饮主要由栀子、黄芩苷、连翘、淡竹叶、甘草以及薄荷油等中药组成，具有疏风散热、清热解毒[1]之功效。原标准收载于原卫生部颁布的中药成方制剂标准第十三册[2]，收载了理化鉴别以及黄芩的薄层色谱鉴别，无具体含量测定项，不容易控制主成分的含量，使该制剂疗效不确切，并为制假、造假提供了便利。本研究主要采用高效液相色谱法（high performance liquid chrotomogrphy，HPLC）[3-6]对黄芩苷的主成分含量进行测定，从而为该成分的准确测定提供一种科学的检验依据。

1 仪器与方法

1.1 仪器

日本岛津高效液相色谱仪，型号：LC-2010CHT；岛津高效液相色谱紫外-可见光检测器；岛津高效液相色谱工作站；依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱；UPW-20NE超纯水纯水器；MS205DU电子分析天平等仪器。

1.2 样品与对照品

供试品：芩霍双清饮，广东万年青制药有限公司；黄芩苷对照品：中国药品生物制品检定所提供，批号：110715-200514；试剂：色谱甲醇、磷酸、乙醇以及超纯水等。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱，以甲醇-冰醋酸-水（50∶1∶50）为流动相；流速：1.0 ml/min，检测波长为278 nm，色谱柱温度为30℃，进样量为10 μl，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500[7]，且阴性无干扰。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取10 ml供试品溶液至锥形瓶中，加入70%乙醇溶液40 ml，先加热回流3 h使其溶解，再转移至50 ml的容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品约12 mg，至200 ml的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度（制成每毫升约含60 μg的溶液），作为对照品溶液[3]。

2.4 测定法

分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

2.5 样品测定

分别取对照品、供试品3批依“2.2”制备供试品溶液与“2.3”制备对照品溶液，按照“2.1”色谱条件，“2.4”测定法进样，测定其峰面积以及计算百分含量并进行比较，平均含量为12.6%，RSD=0.2%（n=3），结果表明本方法简便、准确（表1、表2）。

2.6 线性关系考察

精密称定黄芩苷对照品11.97 mg，按“2.3”项下方法制成浓度为54.85 μg/ml的对照溶液，取上述溶液分别进样5、10、15、20、25 μl，测定色谱峰面积，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程Y=1140.7X-3.583，R2=1，结果表明黄芩苷在0.2992～1.7955 μg范围内呈良好的线性关系（表3、图1）。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，依“2.2”制备供试品溶液，“2.1”色谱条件，“2.4”测定法分别在0、5、10、15、20、25 h依次进样，测得其峰面积以及计算百分含量进行比较，RSD=0.30%（n=6），结果表明供试品溶液在25 h内稳定性良好（表4）。

2.8 精密度试验

取依“2.2”制备的同一供试品溶液，依“2.1”色谱条件，“2.4”测定法连续进样6次，测定其峰面积以及计算百分含量进行比较（表5）。

2.9 重复性试验

取同一供试品溶液取样6份，依“2.2”项下方法分别制备供试品溶液，“2.1”色谱条件，“2.4”测定法测定，测得其峰面积以及计算百分含量进行比较，平均含量为12.7%，RSD=0.12%（n=6），结果表明本方法重复性良好（图2，表6）。

2.10 阴性对照试验

根据处方比例以及制备工艺，配制成不含有黄芩苷的阴性样品，按“2.2”供试品溶液的制备方法制备阴性供试品，按“2.1”色谱条件，“2.4”测定法进样，测定其峰面积以及计算百分含量进行比较，结果显示，阴性供试品溶液没有与黄芩苷对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰（图3～5）。

2.11 加样回收率试验

取已知含量的供试品（含量为12.74%）10 ml，精密加入按“2.3”对照品溶液的制备方法制备的已知含量的对照品溶液（含量为12.07%）10 ml，依“2.2”供试品溶液的制备方法制备混合溶液，按“2.1”色谱条件，“2.4”测定法测定其峰面积以及计算百分含量进行比较，计算黄芩苷的回收率，平均回收率为96.02%，RSD=0.29%（表7）。

3 讨论

据文献报道[7-11]，用HPLC法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量，方法简便，结果准确，可有效控制药品质量，确保疗效。因此，笔者测定芩霍双清饮中主成分黄芩苷的含量方法完全按照《中国药典》2010年版规定的HPLC测定[8]。在此色谱条件下，黄芩苷主峰明显，主峰前、后分离度均>4.0，理论塔板数均在3000以上，完全达到药典含量检测的规定和要求。在实际的操作过程中，还应注意一些问题，如采用甲醇和70%乙醇溶液两种溶剂分别对样品进行超声提取，结果显示，仅用甲醇超声提取，样品提取不是很完全，选用70%乙醇溶液先加热回流3 h，再测定黄芩苷的含量，提取率高 。

黄芩为芩霍双清饮剂中的主药之一，黄芩苷为其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清热解毒的作用[1]。因此选择对黄芩苷进行含量测定，可以有效控制配方中黄芩的质量，进而控制芩霍双清饮的质量。为提高药品质量，确保疗效，笔者参考有关文献[13-15]，采用HPLC法对黄芩中的主要成分黄芩苷进行含量测定。取黄芩苷对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行波长扫描，图谱中黄芩苷在278 nm波长处有最大吸收，故以278 nm为检测波长。曾试用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多种品牌的色谱柱，各色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离度高，本实验色谱柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱。

实验中发现溶解样品的溶剂对黄芩苷的峰形有很大影响，若只以甲醇作为溶剂，黄芩苷的色谱峰会出现明显肩峰，而改用7%乙醇溶液作为溶剂后，肩峰完全消失，峰形明显改善。此外，在样品的制备过程中发现加入甲醇后，样品会出现较多的絮状沉淀，易阻止黄芩苷的进一步析出和溶解，使样品回收率偏低。

综上所述，高效液相色谱法用于黄芩苷的临床测定，方法简便、确切以及重现性较好，可应用于芩霍双清饮中黄芩苷的含量测定，应加以推广及应用。

[参考文献]

[1] 王媛，范全民.HPLC测定清热解毒口服液中绿原酸与黄芩苷含量[J].中国药品标准，2011，12（1）：35.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第十三册[M].北京：人民卫生出版社，1991：41.

[3] 方滢芝，齐藓红.HPLC法测定复方芩芍口服液中黄芩苷的含量[J].中药新药与临床药理，2003，14（2）：119-120.

[4] 应永飞，陈慧华，吴平谷.高效液相色谱-串联质谱在兽药残留分析中的应用[J].分析科学学报，2008，24（3）：359-366.

[5] 罗小敏，陈建真.黄芩及其制剂中黄芩苷定量方法研究进展[J].世界科学技术，2006，8（5）：76-79.

[6] 龙艳华.黄菊颗粒中黄芩的有效成份黄芩苷的含量测定[J].中国药师，2006，9（7）：646-647.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京.化学工业出版社，2010：612.

[8] 苗明，李振陶.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：877-888.

[9] 刘同祥，王慧森.HPLC法测定复方蒲芩片中黄芩苷的含量[J].中国中医药信息杂志，2004，11（3）：225-226.

[10] 付艳敏，李伯军.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量[J].中国药师，2008，11（6）：654-655.

[11] 左惠芳，张金成，张春成.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量[J].西北药学杂志，2008，23（4）：202-203.

[12] 侯艳宁，朱秀媛，陈桂芳.黄芩苷的抗炎机理[J].药学学报，2000，35（3）：161.

[13] 梁远园，冯彪，祝晨蔯，等.HPLC法测定枳实药材中橙皮苷与柚皮苷的含量[J].中国新药与临床药理，2006， 17（5）：359.

[14] 吕凌，路小东，戴萍萍，等.RP-HPLC测定银黄咀嚼片中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中成药，2007，29（6）：921-922.

[15] 刘刚，王海涛，赵淼，等.HPLC 法测定双黄连口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].解放军药学学报，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文编辑：林利利）

3 讨论

据文献报道[7-11]，用HPLC法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量，方法简便，结果准确，可有效控制药品质量，确保疗效。因此，笔者测定芩霍双清饮中主成分黄芩苷的含量方法完全按照《中国药典》2010年版规定的HPLC测定[8]。在此色谱条件下，黄芩苷主峰明显，主峰前、后分离度均>4.0，理论塔板数均在3000以上，完全达到药典含量检测的规定和要求。在实际的操作过程中，还应注意一些问题，如采用甲醇和70%乙醇溶液两种溶剂分别对样品进行超声提取，结果显示，仅用甲醇超声提取，样品提取不是很完全，选用70%乙醇溶液先加热回流3 h，再测定黄芩苷的含量，提取率高 。

黄芩为芩霍双清饮剂中的主药之一，黄芩苷为其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清热解毒的作用[1]。因此选择对黄芩苷进行含量测定，可以有效控制配方中黄芩的质量，进而控制芩霍双清饮的质量。为提高药品质量，确保疗效，笔者参考有关文献[13-15]，采用HPLC法对黄芩中的主要成分黄芩苷进行含量测定。取黄芩苷对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行波长扫描，图谱中黄芩苷在278 nm波长处有最大吸收，故以278 nm为检测波长。曾试用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多种品牌的色谱柱，各色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离度高，本实验色谱柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱。

实验中发现溶解样品的溶剂对黄芩苷的峰形有很大影响，若只以甲醇作为溶剂，黄芩苷的色谱峰会出现明显肩峰，而改用7%乙醇溶液作为溶剂后，肩峰完全消失，峰形明显改善。此外，在样品的制备过程中发现加入甲醇后，样品会出现较多的絮状沉淀，易阻止黄芩苷的进一步析出和溶解，使样品回收率偏低。

综上所述，高效液相色谱法用于黄芩苷的临床测定，方法简便、确切以及重现性较好，可应用于芩霍双清饮中黄芩苷的含量测定，应加以推广及应用。

[参考文献]

[1] 王媛，范全民.HPLC测定清热解毒口服液中绿原酸与黄芩苷含量[J].中国药品标准，2011，12（1）：35.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第十三册[M].北京：人民卫生出版社，1991：41.

[3] 方滢芝，齐藓红.HPLC法测定复方芩芍口服液中黄芩苷的含量[J].中药新药与临床药理，2003，14（2）：119-120.

[4] 应永飞，陈慧华，吴平谷.高效液相色谱-串联质谱在兽药残留分析中的应用[J].分析科学学报，2008，24（3）：359-366.

[5] 罗小敏，陈建真.黄芩及其制剂中黄芩苷定量方法研究进展[J].世界科学技术，2006，8（5）：76-79.

[6] 龙艳华.黄菊颗粒中黄芩的有效成份黄芩苷的含量测定[J].中国药师，2006，9（7）：646-647.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京.化学工业出版社，2010：612.

[8] 苗明，李振陶.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：877-888.

[9] 刘同祥，王慧森.HPLC法测定复方蒲芩片中黄芩苷的含量[J].中国中医药信息杂志，2004，11（3）：225-226.

[10] 付艳敏，李伯军.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量[J].中国药师，2008，11（6）：654-655.

[11] 左惠芳，张金成，张春成.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量[J].西北药学杂志，2008，23（4）：202-203.

[12] 侯艳宁，朱秀媛，陈桂芳.黄芩苷的抗炎机理[J].药学学报，2000，35（3）：161.

[13] 梁远园，冯彪，祝晨蔯，等.HPLC法测定枳实药材中橙皮苷与柚皮苷的含量[J].中国新药与临床药理，2006， 17（5）：359.

[14] 吕凌，路小东，戴萍萍，等.RP-HPLC测定银黄咀嚼片中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中成药，2007，29（6）：921-922.

[15] 刘刚，王海涛，赵淼，等.HPLC 法测定双黄连口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].解放军药学学报，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文编辑：林利利）

3 讨论

据文献报道[7-11]，用HPLC法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量，方法简便，结果准确，可有效控制药品质量，确保疗效。因此，笔者测定芩霍双清饮中主成分黄芩苷的含量方法完全按照《中国药典》2010年版规定的HPLC测定[8]。在此色谱条件下，黄芩苷主峰明显，主峰前、后分离度均>4.0，理论塔板数均在3000以上，完全达到药典含量检测的规定和要求。在实际的操作过程中，还应注意一些问题，如采用甲醇和70%乙醇溶液两种溶剂分别对样品进行超声提取，结果显示，仅用甲醇超声提取，样品提取不是很完全，选用70%乙醇溶液先加热回流3 h，再测定黄芩苷的含量，提取率高 。

黄芩为芩霍双清饮剂中的主药之一，黄芩苷为其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清热解毒的作用[1]。因此选择对黄芩苷进行含量测定，可以有效控制配方中黄芩的质量，进而控制芩霍双清饮的质量。为提高药品质量，确保疗效，笔者参考有关文献[13-15]，采用HPLC法对黄芩中的主要成分黄芩苷进行含量测定。取黄芩苷对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行波长扫描，图谱中黄芩苷在278 nm波长处有最大吸收，故以278 nm为检测波长。曾试用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多种品牌的色谱柱，各色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离度高，本实验色谱柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱。

实验中发现溶解样品的溶剂对黄芩苷的峰形有很大影响，若只以甲醇作为溶剂，黄芩苷的色谱峰会出现明显肩峰，而改用7%乙醇溶液作为溶剂后，肩峰完全消失，峰形明显改善。此外，在样品的制备过程中发现加入甲醇后，样品会出现较多的絮状沉淀，易阻止黄芩苷的进一步析出和溶解，使样品回收率偏低。

综上所述，高效液相色谱法用于黄芩苷的临床测定，方法简便、确切以及重现性较好，可应用于芩霍双清饮中黄芩苷的含量测定，应加以推广及应用。

[参考文献]

[1] 王媛，范全民.HPLC测定清热解毒口服液中绿原酸与黄芩苷含量[J].中国药品标准，2011，12（1）：35.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第十三册[M].北京：人民卫生出版社，1991：41.

[3] 方滢芝，齐藓红.HPLC法测定复方芩芍口服液中黄芩苷的含量[J].中药新药与临床药理，2003，14（2）：119-120.

[4] 应永飞，陈慧华，吴平谷.高效液相色谱-串联质谱在兽药残留分析中的应用[J].分析科学学报，2008，24（3）：359-366.

[5] 罗小敏，陈建真.黄芩及其制剂中黄芩苷定量方法研究进展[J].世界科学技术，2006，8（5）：76-79.

[6] 龙艳华.黄菊颗粒中黄芩的有效成份黄芩苷的含量测定[J].中国药师，2006，9（7）：646-647.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京.化学工业出版社，2010：612.

[8] 苗明，李振陶.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：877-888.

[9] 刘同祥，王慧森.HPLC法测定复方蒲芩片中黄芩苷的含量[J].中国中医药信息杂志，2004，11（3）：225-226.

[10] 付艳敏，李伯军.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量[J].中国药师，2008，11（6）：654-655.

[11] 左惠芳，张金成，张春成.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量[J].西北药学杂志，2008，23（4）：202-203.

[12] 侯艳宁，朱秀媛，陈桂芳.黄芩苷的抗炎机理[J].药学学报，2000，35（3）：161.

[13] 梁远园，冯彪，祝晨蔯，等.HPLC法测定枳实药材中橙皮苷与柚皮苷的含量[J].中国新药与临床药理，2006， 17（5）：359.

[14] 吕凌，路小东，戴萍萍，等.RP-HPLC测定银黄咀嚼片中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中成药，2007，29（6）：921-922.

[15] 刘刚，王海涛，赵淼，等.HPLC 法测定双黄连口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].解放军药学学报，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文编辑：林利利）