PM2.5通过线粒体介导的大鼠心肌细胞损伤作用机制的初步研究

郑贵浪 廖保南 林千文

PM2.5通过线粒体介导的大鼠心肌细胞损伤作用机制的初步研究

郑贵浪 廖保南 林千文

目的 初步探讨PM2.5对大鼠心肌细胞的损害及线粒体介导的相关作用机制。方法 培养大鼠心肌细胞株H9C2细胞，给予PM2.5刺激，24 h后检查肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH），比色法检测线粒体的活性氧（ROS）和ATP酶的活性，流式细胞仪检测线粒体肿胀度及膜电位。结果 PM2.5组心肌细胞CK 和 LDH 明显升高［（702±80）U/ml比（987±92）U/ml，（339±72）U/L 比（485±84）U/L）］，ATP 酶活性下降明显［（34.2±5.2）U/mgprot比（54.1±6.9）U/mgprot］，细胞内 ROS 明显增多［（67.2±8.2）U/well比（25.4±7.3）U/well］，差异均有统计学意义（P<0.05）。同时PM2.5组心肌细胞线粒体明显肿胀，线粒体膜电位明显下降（0.3476±0.1232比0.6476±0.1021），差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 PM2.5可以导致心肌细胞损伤，其机制可能与PM2.5损害线粒体的结构与功能相关。

PM2.5；心肌细胞；线粒体；膜电位；活性氧

颗粒物是城市主要的大气污染物，其粒径大小、形态及组成成分都与人体健康密切相关。其中空气动力学直径＜2.5μm的细颗粒物（PM2.5）与人体健康关系最为密切。PM2.5主要来自于人类活动如工业生产及交通运输工具尾气排放、吸烟的烟雾释放等。其化学成分复杂，包括无机成分、有机成分、微量重金属元素和元素碳等[1,2]。

流行病学调查研究显示，PM2.5与人类心血管疾病有密切关系，不但可增加高血压、冠心病、糖尿病患者的心血管疾病发病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病发病率和死亡率[3-5]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指具有氧化还原潜能的氧衍生物，包括游离的基团如超氧阴离子、羟自由基、次氯酸盐、过氧亚硝酸盐和稳定的基团如过氧化氢。越来越多的研究发现，其与体内氧化应激长期慢性的过度激活有关[6]。有不少研究[7-9]显示，PM2.5的毒性作用与ROS过多产生有关。

线粒体是细胞的“动力工厂”，同时也是ROS产生的重要部位。然而，PM2.5是否损害心脏，是否可以通过损害线粒体，使ROS产生过多，进而损害心肌细胞？目前研究甚少。本研究拟采用大鼠心肌细胞株H9C2，通过体外给予PM2.5刺激，检测细胞损伤及线粒体ROS等变化，初步揭示PM2.5对心肌细胞的损伤机制。

1 材料与方法

1.1 PM2.5的采样及配制 采样：选取湛江市区汽车流量大、污染较重的地区为采样点。用PM2.5采样仪采集PM2.5于专用滤纸上，采样后将载有颗粒物的滤纸剪成1 cm2小块，浸于三蒸水中，超声震荡30 min×4次，洗脱颗粒物，震荡液经6层纱布过滤，滤液4℃，10 000 rpm/min离心20 min后收集下层悬液于玻璃平皿中，冷冻真空干燥成干粉，－20℃保存备用。配制：称取一定量PM2.5干粉，经紫外线照射30 min后，在超净台中加入培养基溶液混匀，配制成终浓度为 10、50、100 μg/ml的溶液进行预实验。根据预实验结果，选用50 μg/ml作为本实验的刺激剂量。

1.2 H9C2细胞培养、分组及处理 H9C2细胞株购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库，用10%小牛血清培养液，在37℃培养箱静置培养；1～3 d更换一次培养液。PBS轻柔冲洗，适量0.25%胰酶溶液消化等常规操作，进行传代及实验。当细胞生长至70%左右密度时，进行后续的实验研究。H9C2细胞分成两组，每组3个样本。PM2.5组和正常对照组（NC组）分别给予50 μg/ml的PM2.5培养基和无PM2.5培养基刺激。刺激后6 h更换培养液，24 h检测相关指标。

1.3 肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）检测H9C2大鼠心肌细胞PM2.5刺激后24 h，收集细胞上清液，按照试剂盒说明进行检测。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（比色法），货号 A020-1；肌酸激酶（CK）测定试剂盒（比色法），货号A032。两试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 线粒体的提取 按照线粒体提取试剂盒说明书操作（购自南京建成生物工程研究所，货号：G003）。简要步骤：常规收集细胞，用PBS洗涤一次，离心收集细胞，吸尽上清。每次提取需要5×107个细胞。加入裂解液重悬细胞，放置10 min，研磨细胞30～40次。转移到预冷的离心管中，离心，取上清。取上清液0.5 ml与0.5 ml溶液A混合，离心后的上清为胞浆成分，沉淀则为线粒体。弃上清，往沉淀中加入漂洗液重悬线粒体沉淀，离心弃上清。用50～100 μl储存液重悬线粒体沉淀，立即使用。电镜鉴定确定提取的是线粒体。

1.5 线粒体肿胀程度的检测 取1 ml线粒体混悬液进行心肌线粒体肿胀程度的流式细胞仪分析，用前向角与侧向角平均荧光强度的比值（FSC/SSC）表示线粒体的肿胀程度[10,11]。

1.6 线粒体膜电位的检测 按照凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）说明书操作（购自凯基生物，货号：KGA604）。简要步骤：收集不多于 1×106的细胞；Incubation Buffer预热至 37℃，加入JC-1。JC-1工作液将细胞均匀悬浮，孵育15～20 min；Incubation Buffer洗2次；流式细胞仪分析。结果采用PI通道和PITC通道的平均荧光强度的比值（PI/PITC）表示线粒体膜电位[10]。

1.7 线粒体ROS检测 按照活性氧检测试剂盒进行操作，试剂盒购自碧云天，货号S0033。简要步骤为：各组细胞经过处理后，按照试剂说明用1∶1000无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μm。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFHDA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1 ml。37℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用荧光分光光度计检测[12]，激发波长488 nm 和 535 nm，测定 5～10 min。

1.8 线粒体ATP酶活力的测定 按照ATP酶试剂盒（比色法）操作。试剂盒货号：A016-1，购自南京建成生物工程研究所。ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。

1.9 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行分析。所有计量资料均以±s表示，方差齐时成组t检验，方差不齐时采用近似t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组心肌细胞CK和LDH比较 PM2.5组心肌细胞 CK 为（702±80）U/ml，LDH 为（987±92）U/L，均明显高于 NC 组的（339±72）U/ml和（485±84）U/L，差异有统计学意义 （t1=5.8，P<0.05；t2=6.9，P<0.05）。PM2.5导致心肌细胞损伤。见表1。

表1 两组CK、LDH、线粒体肿胀度和线粒体膜电位的比较（±s）

表1 两组CK、LDH、线粒体肿胀度和线粒体膜电位的比较（±s）

注：与NC组相比，aP<0.05

线粒体膜电位（PI/PITC）NC 组 339±72 485±84 0.4693±0.0653 0.6476±0.1021 PM2.5 组 702±80a 987±92a 0.6457±0.0734a 0.3476±0.1232a组别 CK（U/ml）LDH（U/L）线粒体肿胀度（FSC/SSC）

2.2 两组心肌细胞线粒体肿胀程度及膜电位比较流式细胞仪检测示，PM2.5组肿胀程度明显高于NC 组，差异有统计学意义（t=3.1，P<0.05）；PM2.5组的线粒体膜电位低于NC组，差异有统计学意义（t=3.2，P<0.05）。电镜检查可见，PM2.5组心肌细胞与NC组相比，线粒体肿胀，线粒体嵴模糊，基质凝固、部分空泡化。提示PM2.5损害了线粒体结构。见表1、图 1～3。

2.3 两组心肌细胞细胞内ROS及线粒体ATP酶活性比较 PM2.5组心肌细胞内ROS水平明显高于 NC 组，差异有统计学意义（t=6.6，P<0.05）；而其ATP酶活性却明显低于NC组，差异有统计学意义（t=4.0，P<0.05）。提示PM2.5损害了线粒体的功能。见表2。

3 讨论

图1 心肌细胞线粒体肿胀程度流式分析图

图2 心肌细胞线粒体膜电位

图3 心肌细胞线粒体电镜观察（×30 000）

近年来，环境污染越来越受到关注。大气污染的重要物质PM2.5，可作为载体吸附有毒重金属、酸性氧化物、有机污染物、细菌和病毒等多种组分，成为毒物富集中心和化学反应床，严重危害人体健康。PM2.5对人体呼吸系统的影响，得到了深入广泛的研究；对心血管系统的影响，也备受关注。有学者[13,14]在动物实验及临床流行病学调查中发现，PM2.5可抑制心脏搏动，引起心率变异性降低，心肌细胞变性和间质细胞增生，导致以心肌间质纤维化为主要表现的心肌重构；使血管收缩，血压上升；通过氧化应激反应损伤血管黏膜，引起血管通透性及血液黏度增加，加速主动脉和冠状动脉粥样硬化和斑块破裂过程[15]；诱发心律失常、心肌缺血甚至心脏停搏[16,17]。

表2 两组心肌细胞细胞内ROS及线粒体ATP酶活性比较（±s）

表2 两组心肌细胞细胞内ROS及线粒体ATP酶活性比较（±s）

注：与NC组相比，aP<0.05

线粒体ATP酶活性（U/mgprot）NC 组 3 25.4±7.3 54.1±6.9 PM2.5 组 3 67.2±8.2a 34.2±5.2a组别 样本 细胞内ROS（U/Well）

本研究通过大鼠心肌细胞株，发现PM2.5可以引起心肌细胞肌酸激酶和乳酸脱氢酶增高，提示其对心肌细胞的毒性作用。血管疾病的致病过程是一个长期积累的过程，目前已知的致病因素包括吸烟、酗酒、肥胖及高钠、高脂饮食等。PM2.5可诱发、加重人体的心血管病变，这一结论已得到越来越多的实验证据支持。段军等[18]在大鼠动物实验中发现，PM2.5能增加大鼠左右心室心肌细胞合成和分泌NGF蛋白，从而导致心室交感神经分布密度增加，证实具有致交感神经重构作用。董晨等[16]发现PM2.5对SH大鼠心脏有一定的急性毒性作用，并可引起心脏重构。郑灿军等[19]发现，PM2.5及其组分还可抑制心肌细胞的搏动频率，并存在剂量-反应关系。此外，国外也有不少研究[20-22]报道PM2.5对心血管系统的影响。本实验从心肌细胞株角度出发，从另一个侧面揭示了PM2.5对心血管系统的毒性作用。

线粒体普遍存在于真核细胞中，细胞生命活动所需能量的80%来源于线粒体，是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所。线粒体的主要功能是合成ATP。通过三羧酸循环和氧化磷酸化，将糖类、脂肪和氨基酸氧化并合成能量。此外，线粒体也是细胞活性氧（ROS）产生的重要基地。生理状态下，线粒体产生少量的ROS，对细胞有利；在某些病理条件下，线粒体产生大量的ROS，导致细胞器、DNA及膜结构等损坏，甚至导致细胞凋亡、坏死[23]。有研究[24]显示，线粒体ROS的产生与线粒体的膜电位密切相关。

本研究发现，PM2.5毒染的心肌细胞出现线粒体肿胀，线粒体嵴模糊，基质凝固，明显损害了线粒体的形态结构。进一步检测发现，PM2.5毒染的心肌细胞内ROS明显增高，而线粒体的ATP酶活性却下降，提示PM2.5破坏了线粒体的正常能量代谢，引起线粒体ATP酶活性不足，导致细胞能力障碍，同时产生大量的ROS，进而损害细胞的结构与功能。更进一步检测线粒体的膜电位发现，PM2.5组线粒体膜电位明显下降，这可能是PM2.5的毒性影响或者是细胞能量障碍和ROS产生过多损害了线粒体的内外膜电势所致。然而，到底是ROS产生过多导致了膜电位的改变，抑或膜电位的改变导致了ROS的产生，尚需进一步的实验加以证实。PM2.5对线粒体的影响国内外有少量研究[25-27]。PM2.5可以诱导Ⅱ肺泡上皮细胞（AECⅡ）通过线粒体途径发生凋亡，导致AECⅡ增殖下降[28]；PM2.5引起上皮细胞和肺泡巨噬细胞线粒体超微结构和膜电位异常改变，对线粒体和细胞造成损伤[29]；PM2.5可引起人肺腺癌A549细胞线粒体SDH活力下降，溶酶体ACP漏出增加，细胞膜通透性增加[30]。本研究从心肌细胞线粒体角度出发，发现PM2.5对心肌细胞线粒体的毒性作用机制，目前鲜见类似报道。

综上所述，PM2.5可导致大鼠心肌细胞的损害，这可能是由于PM2.5损害心肌细胞的线粒体结构与功能所致。

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The preliminary study of the injury mechanism of rat cardiomyocytes caused by PM2.5 via mitochondria

ZHENG Gui-lang＊，LIAO Bao-nan，LIN Qian-wen.＊Department of Pediatrics，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，China

Objective To investigate the toxicity of PM2.5 on the rat myocardial cells and the function of mitochondrial during the damage.Methods Rat cardiomyocytes H9C2 cell lines were cultured，after 24 hours of given PM2.5 stimulus，creatine kinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）were detected.Mitochondrial reactive oxygen species （ROS）and ATP enzyme activity were determinated by colorimetric detection.Flow cytometry was used to analyze mitochondrial swelling and membrane potential.Results Compared with the NC group，CK and LDH were elevated（702±80）U/ml vs（987±92）U/ml，（339±72）U/ml vs（485±84）U/ml，ATP activity decreased（34.2±5.2）U/mgprot vs（54.1±6.9）U/mgprot，intracellular ROS increased（67.2±8.2）U/well vs（25.4±7.3）U/well，myocardial cell mitochondria were swollen significantly，membrane potential decreased greatly in the PM2.5 group（0.3476±0.1232 vs 0.6476±0.1021）.And the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion PM2.5 can lead to myocardial cell damage，which may be related to the structure and function of damaged mitochondrial caused by PM2.5.

PM2.5；Myocardial cells；Mitochondria；Mitochondrial membrane potential；ROS

湛江市非资助科技攻关计划项目（项目编号：2013B01133）

524000 广东省湛江市，广东医学院附属医院儿童医学中心（郑贵浪、林千文）；坡头区官渡镇卫生院（廖保南）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.10.022

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2014）10-0939－05

2014-07-16）