眼针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑皮层组织FADD表达的影响

赵丹玉 王 哲 曹 阳 王德山

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847)

眼针疗法为我校著名老中医彭静山教授所创，是一种微针疗法。百余万病例实践证明，眼针对于急性脑中风以及顽固性疼痛等优势病种疗效显著，但是其机制尚不清楚。本课题建立大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型，研究眼针对于CIRI大鼠损伤侧大脑皮层组织Fas相关凋亡结构域蛋白(FADD)表达的影响，研究眼针对于CIRI的作用机制,为“眼络于脑”的中医理论假说提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性SPF级Wistar雄性大鼠，体重280～320 g。购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物许可号：SCXK(沪)2008-0016。RNAiso Reagent和RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司；SABC免疫组织化学试剂盒、一抗FADD、GAPDH多克隆抗体及山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2动物分组与模型复制 大鼠以随机数字法分为正常组、假手术组、模型组和眼针组，剔除造模不成功以及死亡鼠，最终每组保证至少18只。正常组：常规喂养无任何施加因素。模型复制与成模标准：采用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(MACO)再灌注动物模型(右侧栓塞)〔1〕。造模后参照Longa 5分制评分标准进行神经功能缺损评分〔2〕。以神经功能缺损评分≥1分者视为造模成功。将造模成功的大鼠再随机分为模型组和眼针组。假手术组：术式与操作基本过程同模型组和眼针组，只是不进行大脑中动脉栓塞。模型组常规喂养，不给予任何刺激。眼针组在缺血再灌注即刻、造模术后12 h及造模术后24 h即处死前各针刺1次。

1.3眼针取穴与刺法 取穴参照人体取穴定位法分别取：上焦区、下焦区、肝区、肾区〔3〕；刺法：用35 mm×25 mm毫针在相应眼穴区距眶内缘2 mm处，平刺，由该区始点向该区终点方向，刺入0.3 cm，行捻转手法，留针30 min，15 min行针1次，时间1 min。

1.4RT-PCR检测FADD mRNA表达 于造模术后24 h每组各取6只鼠，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,迅速断头取脑，分离右侧皮层组织。总RNA提取用RNAiso Reagent试剂，按说明操作。提取后的总RNA以分光光度法鉴定其纯度。用RT-PCR试剂盒进行逆转录及聚合酶链反应。FADD的引物序列为：正义链CTGGGCAGACACGACCTAC，反义链TCCCTTACCCGATCACTCA，长度：221 bp，退火温度：65℃；β-actin的引物序列为：正义链GCACCAAGTGCCACAAAGGAA，反义链TGCGAAGCTGTAAAGGTGCCT，长度：592 bp，退火温度：65℃。RT-PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，拍照，凝胶扫描系统进行吸光度积分分析(IOD)，以FADD的RT-PCR产物IOD和内参β-actin的RT-PCR产物的IOD比值显示FADD mRNA的表达变化。

1.5免疫组化检测FADD蛋白表达 于造模术后24 h每组各取6只鼠，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，先后用生理盐水及4 %多聚甲醛心内灌流，迅速断头取脑，取额极至中脑间脑组织冠状面置于4%多聚甲醛中后固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每隔100 μm连续作5 μm厚脑冠状面石蜡切片。石蜡切片进行免疫组化染色，具体步骤按即用型SABC免疫组织化学试剂盒说明书操作。最后于高倍物镜下观察、照相及图像处理分析，测定平均光密度值(MOD)。每张切片测定6个视野取平均值作为测定值。

1.6Western印迹检测FADD蛋白表达 于造模术后24 h每组各取6只鼠，麻醉后,迅速断头取脑，于无菌条件下冰上分离右侧皮层组织，加入相应体积的裂解液后匀浆， 12 000 r/min离心30 min，收集上清，检测各样本蛋白浓度。将样品和蛋白分子量标准分别加入胶孔内开始电泳。电泳完毕，半干式转印槽印迹约1.5 h，封闭，37℃，2 h，加入适当稀释的一抗(FADD、GAPDH均以1∶100用封闭液稀释)，4℃过夜。TBST冲洗后加入1∶2 000稀释的酶标二抗，37℃，45 min。DAB显色。扫描硝酸纤维素膜上的条带，凝胶扫描系统进行吸光度积分分析(IOD)，以GAPDH作为内参，各组IKKβ、NF-κB的蛋白表达强度IOD和内参GAPDH的蛋白表达强度IOD比值显示各组IKKβ、NF-κB的蛋白表达变化

2 结 果

2.1眼针对CIRI 模型大鼠一般状态影响 假手术组大鼠手术完成动物苏醒后，无神经功能缺损体征出现，根据神经功能缺损评分标准进行评分，平均为0分。造模成功的大鼠苏醒后出现明显的不能完全伸展对侧前爪、向对侧转圈及向对侧倾倒等神经功能缺损症状。术后24 h,模型组动物神经功能缺损症状随时间延长逐渐加重，神经功能缺损评分具有明显上升趋势；眼针组神经功能缺损症状加重不明显，显示出眼针治疗的脑保护作用。

2.2眼针对CIRI模型大鼠大脑皮层组织FADD mRNA 表达影响 通过对电泳的结果以及凝胶扫描系统进行吸光度积分分析，RT-PCR检测结果如图1、图2、表1所示，正常组及假手术组大鼠右侧大脑皮层组织FADD的 mRNA 均表达较少，二者之间没有显著差异(P>0.05)；同正常组与假手术组相比较，CIRI模型组FADD呈现明显高表达(P<0.01)；而眼针组的表达较模型组明显下降(P<0.01)。

1、2、3泳道：正常组；4、5、6泳道：假手术组；7、8、9泳道：模型组；10、11、12泳道：眼针组

1、2、3泳道：正常组；4、5、6泳道：假手术组；7、8、9泳道：模型组；10、11、12泳道：眼针组

表1 眼针对CIRI模型大鼠缺血侧大脑皮层组织FADD表达的影响

2.3眼针对CIRI模型大鼠大脑皮层组织FADD蛋白表达影响

2.3.1免疫组化结果 以图3、表1所示，染色结果可见，正常组及假手术组大鼠右侧大脑皮层组织鲜见的FADD阳性细胞表达。CIRI模型组可见较多的FADD阳性细胞，胞浆着色，与正常组和假手术组比较有显著性差异(P<0.01)；眼针组阳性细胞数量显著减少，同模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3.2Western印迹结果 通过对免疫印迹的结果进行吸光度积分分析，如图4、图5及表1所示，正常组及假手术组大鼠右侧大脑皮层组织FADD蛋白均表达较少，二者之间没有显著差异(P>0.05)；同正常组与假手术组相比较，CIRI模型组FADD呈现明显高表达(P<0.01)；而眼针组表达较模型组明显下降(P<0.01)。

图3 眼针对CIRI模型大鼠缺血侧大脑皮层组织FADD蛋白表达影响(IHC，DAB染色，×400)

1：正常组；2：假手术组；3：模型组；4：眼针组

1：正常组；2：假手术组；3：模型组；4：眼针组

3 讨 论

CIRI在脑血管病的发病及相应的治疗过程中起重要作用。近年来研究发现CIRI与细胞凋亡有着密切的关系〔3〕，凋亡机制参与CIRI已成为临床研究的热点。凋亡主要发生在半暗带区，即介于缺血坏死灶和正常组织之间的区域，半暗带凋亡的发生参与梗死灶的发展,最终决定脑梗死的体积〔4，5〕。改善半暗带区的细胞凋亡是防治CIRI重点要解决的问题。

神经元凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程，在不同的刺激信号影响下，涉及多个基因表达及相互作用的复杂过程〔6〕。死亡受体通路是导致凋亡的重要信号通路。死亡受体通路包括Fasl/Fas和TNFα/TNFR1两条通路。FADD是死亡信号转导通路中的一个重要的连接蛋白。FADD是存在于胞浆中的一种含死亡结构域(DD)的连接蛋白。分子中包含两个结构域，即C末端的DD和N末端的死亡效应结构域(DED)。DD结构域是FADD与其上游分子Fas、TRADD(TNFR1的下游分子)结合的部位；DED结构域是其诱导凋亡的活性部位，而且已证明FADD的DED寡聚化作用,足以引起凋亡的发生。由此可见，FADD是Fas1/Fas和TNFα/TNFR1两条信号转导通路共同的连接分子，在凋亡的发生过程中处于中心环节。

彭静山教授所创的眼针疗法根据中医目诊的基本理论“八廓学说”，用后天八卦将眼睛分为八区，并根据《证治准绳》《目门》卷七中引用华佗的话将眼周分为十三穴，根据各区内白睛脉络的变化，配以脏腑，用以“观眼识病”并根据具体病情辩证取穴。中风之发生，病机较复杂.归纳起来不外虚、火、风、痰、气、血六端，其中以肝肾阴虚为其根本，此六端在一定条件下，互相影响，相互作用而突然发病。心、肝、肾三脏阴阳失调是中风重要病机，肝肾阴虚，肝阳偏亢。因此眼针取穴取肝区平肝潜阳，调畅气机，调理藏血；取肾区以滋阴补肾，填精益髓，从而使肝血肾精充盛。

本课题前期研究表明,眼针可以有效抑制缺血半暗区细胞凋亡，改善局部缺血缺氧从而改善缺血半暗区微循环，对脑缺血再灌注损伤起保护作用〔7〕。本实验结果表明，同正常组及假手术组相比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显增高，结合本课题其他检测指标〔8，9〕，说明CIRI造模成功。模型组大鼠缺血侧大脑皮层组织中FADD的mRNA及蛋白表达均明显高于正常组及假手术组，提示CIRI状态下，FADD表达显著增强，同以往的研究结果一致〔10〕。眼针治疗后大鼠神经功能缺损状况显著改善，FADD基因及蛋白表达明显下降。作为死亡受体通路的中心物质表达降低，提示死亡受体通路极可能被抑制，从而半暗带区细胞的凋亡受到抑制，起到防止梗死灶迅速扩大，保护脑组织的作用，这可能是眼针抑制CIRI半暗带区的凋亡的主要机制之一。FADD表达的下调是否为眼针刺激对于整个信号通路的调节靶点，还待今后作进一步的研究。

4 参考文献

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3Endres M,Kaps M,Moskowitz MA.Apoptosis and ischemic infarct〔J〕.Nevenarzt，1998；69(6):459-64.

4王荫华,周 炯.凋亡与缺血性脑血管病〔J〕.中国康复理论与实践，2003；9(9):518-20.

5Yao H,Takasawa R,Fukuda K,etal.DNA fragmentation in ischemic core and penumbra in focal cerebral ischemia in rats〔J〕.Brain Res Mol Brain Res,2001；91(1/2):112-8.

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7王鹏琴,刘若实,周 杰,等.眼针对局灶脑缺血再灌注损伤保护机制研究—神经功能及半暗区细胞凋亡影响〔J〕.中华中医药学刊,2011；29(4):735-7.

8张立德,于 丹,曲 怡,等.眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞间黏附因子-1表达的影响〔J〕.针刺研究,2011；36(6):409-13.

9贾晓杰,谢 鑫,王哲,等.眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠血中SOD、MDA及BDNF含量的影响〔J〕.中华中医药学刊,2012；30(3):486-8.

10陈本阳,张智博,唐 璇,等.大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及Fas凋亡通路相关因子表达及意义〔J〕.中国现代医学杂志,2009；19(1):64-7.