针刺治疗对COPD模型大鼠Th1/Th2细胞亚群格局的影响

程 淼 张新芳 张 洁 蔡圣荣 周传云 翟从永 盛东亚 刘 睿 刘自兵

(安徽中医药大学针灸骨伤临床学院针灸经络研究所，安徽 合肥 230038)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以不完全可逆的气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病，气流受限并呈进行性发展，其反复发作将损害机体免疫系统的功能，而免疫功能低下可使呼吸道感染率和病死率明显增加〔1〕。辅助性T淋巴细胞(T cell helper，Th)亚群与COPD的发生具有重要关系〔2，3〕。最近有人观察到COPD患者存在Th1/Th2平衡失调〔4〕。在正常情况下，Th1/Th2 细胞处于相对平衡的状态，但机体发生功能异常时，常表现出平衡偏向其中一方，此即为“Th1/Th2平衡漂移”。一旦Th1/Th2 之间的平衡状态被打破，很可能造成人体细胞因子网络的动态平衡被破坏，进而引起许多疾病的产生和发展。故在综合治疗COPD的同时，积极有效地改善COPD患者体内的免疫平衡状态，增强机体的免疫功能，对减慢病程进展、提高患者生活质量尤为重要。临床观察和大量实验研究资料证实针刺具有调整和增强机体免疫功能的作用，从而起到防病、治病“扶正固本”的功效〔5〕。但针刺是否能调节Th1/Th2平衡失调，尚未见报道。因此，本实验通过电针COPD模型大鼠，检测外周血浆及肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-4的含量，分析针刺对Th1/Th2平衡失调的调节作用，为临床应用针刺治疗COPD，改善免疫功能提供实验依据。

1 资料与方法

1.1动物分组及模型复制 实验用SPF级Sprague-Dawley 雄性大鼠40只，购自上海必凯实验动物有限公司〔许可证号：SCXK(沪)2008-0016，合格证号：2008001619110〕，体重为160～180 g，适应性喂养1 w。随机分为正常对照组、模型组、电针7次组和电针14次组，每组10只。COPD模型大鼠的造模方法参照文献并进行了改良〔6〕：将模型和电针组30只大鼠于烟熏前1 d及烟熏第15天，以6%水合氯醛麻醉，颈部切口，分离气管，以1 ml注射器气管内注射浓度1 mg/ml的脂多糖溶液，200 μg/鼠，术后40万单位青霉素抗炎。烟熏时，将大鼠置于自制1 m3的烟熏箱内，将30支红三环牌香烟(焦油量11 mg，烟气烟碱量0.8 mg/支，烟气一氧化碳量15 mg；安徽中烟工业公司)点燃放入箱内，每天下午4点进行烟熏，每日45 min，自由进食进水，连续烟熏12 w。对照组大鼠呼吸洁净空气。

1.2电针方法 烟熏第9周开始，电针组大鼠在烟熏前接受电针治疗，大鼠以6%的水合氯醛轻度麻醉(240 mg/kg，低于正常麻醉剂量420 mg/kg)，适当刺激大鼠尚能爬行，针刺结束时大鼠即可自由活动。穴位取双侧足三里(ST36，即后三里，定位于大鼠膝关节后外侧，在腓骨小头下方5 mm，胫腓骨间隙处)、肺俞穴(BL13，定位于大鼠背部第三胸椎下两旁肋间)〔5〕，针灸针柄以导线联接华佗牌SDZ-V型程控多功能电针治疗仪(苏州产)，参数采用4/20 Hz交替频率，强度为1级(相当于2 mA)，以引起大鼠后肢轻微抖动为度。下午2点进行针刺，每次电针治疗30 min，隔日1次，分别连续针刺治疗7次和14次，正常对照及模型组大鼠均以等剂量麻醉而不针刺。

1.3观察肺功能和肺组织病理 针刺结束后次日，以3%戊巴比妥钠麻醉大鼠(70 mg/kg)，气管插管后置于大鼠体描箱，接好导管，连接呼吸机、呼吸信号调理器及负压器，开启计算机，打开AniRes2005动物肺功能分析软件(北京贝兰博科技公司)，记录吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)和肺动态顺应性(Cydn)。大鼠处死后取肺组织，常规4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，采用奥林巴斯BX51型光学显微镜，取200倍视野观察并摄片。

1.4ELISA方法检测支气管肺泡灌洗液及血浆IFN-γ和IL-4含量 血浆采集方法：肺功能检测结束后，以采血针取大鼠腹主动脉血置于抗凝管，4℃ 3 000 r/min离心(长沙湘仪TGL-16M型台式冷冻离心机)15 min，取上清。支气管肺泡灌洗液(BALF)抽取方法：大鼠取血后开胸，分离纵隔，止血钳钳住右总支气管，注射器分两次抽取3 ml生理盐水从气管插管推入左肺，每次反复灌洗3下后抽出灌洗液，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清。采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测BALF及血浆中IFN-γ和IL-4，试剂盒购自上海源叶生物技术有限公司(IL-4批号：12889R；INF-γ批号：12562R)，操作程序严格按照说明书操作。主要步骤为：①标准品的稀释；②加样；③配液；④洗涤；⑤显色；⑥终止；⑦以BIO-RAD公司iMARK型号酶标仪测量450 nm波长的吸光度(OD值)；8)计算出对应的样品浓度。

2 结 果

2.1针刺对COPD模型大鼠肺功能和肺病理的影响 在肺功能的指标中，模型组大鼠的呼气阻力比正常对照组升高(P<0.05 )，但吸气阻力及肺动态顺应性与对照组相比无统计学差异(P>0.05)，表明模型大鼠有呼气受限；针刺7次后，吸气和呼气阻力均比模型组显著下降(P<0.01 )，且肺动态顺应性显著增加(P<0.01)，表明针刺显著改善了肺通气功能。与针刺7次相比，针刺14次后吸气阻力的降低和肺动态顺应性增加的幅度均较低(P<0.05 )，说明针刺7次即能改善模型大鼠的肺功能。见表1。光镜下观察肺病理结果可见，对照组大鼠肺泡、肺间隔及小气道结构完整、清晰、匀称；模型组肺间隔增厚，且有大量炎性细胞浸润，肺泡减少，小气道管腔有大量黏液分泌及堵塞，管壁变形及增厚；电针后肺间隔变薄，肺泡面积相应增加，小气道管腔黏液分泌及堵塞情况改善(图1)。

表1 针刺对COPD模型大鼠的吸气阻力、呼气阻力及肺动态顺应性的影响

A：正常对照组(肺泡结构清晰、匀称)；B：模型组(肺间隔增厚，大量炎性细胞浸润；小气道管腔多见分泌物)；C:电针7次组(肺间隔变薄、气道分泌物减少)；D：电针14次组

2.2针刺对COPD大鼠BALF及血浆中IFN-γ、IL-4的影响 ELISA方法的检测结果显示，与对照组相比，在模型组大鼠BALF及血浆中IFN-γ含量均非常显著升高(P<0.001)；IL-4含量也有不同程度升高(P<0.05；P<0.01)。可见，IFN-γ比IL-4含量的升高更为显著，表明Th1细胞在模型组中占有优势，Th1/Th2平衡倾向于Th1(表2)。与对照组IFN-γ/IL-4比较，模型组大鼠BALF中的比值显著降低(P<0.01)，但血浆中比值增高(P<0.05)，表明在肺的局部环境中，Th2占优势，而在全身反应中，依然是Th1占优势。见表3。

与模型组相比，在电针7次、14次组大鼠BALF及血浆中，IFN-γ和IL-4含量均有不同程度降低(P<0.05；P<0.001)，可见电针下调了模型大鼠IFN-γ、IL-4的含量；电针两组相比，除14次组BALF中IFN-γ下调更多(P<0.01)，余均无统计学差异(表2)。与模型组BALF中IFN-γ/IL-4比较，电针7次组的比值显著升高(P<0.001)，而电针14次组却无明显变化(P>0.05)，且与电针7次组差异显著(P<0.001)；电针后，血浆中的IFN-γ/IL-4均无统计学差异(P>0.05)(表3)。表明针刺对肺及全身的Th细胞均有调节作用，且电针7次即可发挥较大的调节效应。

表2 针刺对COPD大鼠肺泡灌洗液及血浆中IFN-γ和IL-4的影响

表3 针刺对COPD大鼠肺泡灌洗液及血浆中IFN-γ/IL-4的影响

2.3IFN-γ和IL-4与肺功能的相关性分析 以BALF和血浆中的IFN-γ和IL-4与肺功能中关键指标Re进行Pearson相关性分析，结果显示，血浆中IL-4与Re呈显著正相关(r=0.937,P<0.01)，其他无明显相关性(r=0.293～0.479,P>0.05,n=7)，表明关键肺功能指标的变化可能受IL-4的影响。

3 讨 论

COPD患者存在细胞免疫功能紊乱和低下〔1〕。近年来的研究发现部分患者在戒烟后，肺部的损害并未完全停止，仍有持续进展，因此，也有学者提出，COPD 是自身免疫性疾病的假设〔7〕。Th1与Th2细胞之间的动态平衡对维持机体正常的免疫功能起重要作用，Th1细胞功能亢进可促进某些器官特异性自身免疫病的发展。Th细胞亚群平衡失调与COPD这一炎症性疾病的发生具有重要关系〔8，9〕。

研究者多以检测IFN-γ和IL-4(或IL-10)的含量及IFN-γ/IL-4，来反映Th1和Th2细胞亚群，并分析Th1/Th2免疫平衡〔10〕。在呼吸疾病中，一般认为，哮喘气道炎症主要与Th2功能亢进相关，COPD气道炎症主要与Th1细胞相关，但也有研究表明COPD与哮喘一样均表现为Th2功能亢进特征〔4〕。本实验动物模型符合COPD在病理和肺功能上的特点，同时，Th1细胞占有优势，Th1/Th2平衡格局倾向于Th1。

COPD病程复杂，最近Tsoumakidou等〔11〕根据COPD临床分期的不同，观察到急性加重期Th细胞平衡可能表现出与稳定期不同的特点，急性加重期Th1细胞平衡呈现出向Th2端漂移的特点。且COPD炎症机制复杂，与经典的Th1或Th2介导的自身免疫性疾病相比，缺乏典型的特征〔12〕。故在临床上，经典的免疫调节剂、免疫抑制剂治疗收效甚微。

针刺是我国传统中医疗法，用于治疗和预防疾病已有数千年的历史。针刺治疗呼吸系统疾病，一直受到针灸学者的重视。早在1961年萨藤山川等报道针刺可使哮喘患者呼吸道的阻力下降。1981年张笑平报道连续针刺肺俞穴1 w可使哮喘患者的肺通气量明显增加，且停针后其效应仍可维持较长时间。1997年张压西等发现针刺肺俞穴能明显改善肺通气功能，在肺俞穴不同的留针时间对患者的肺通气功能有不同的改善。德国〔13〕和日本学者〔14〕的研究均发现COPD患者用针刺进行治疗，治疗14 d后肺通气功能显著得到改善，生活质量也有较大程度的提高。针刺不仅可以改善肺及支气管的通气功能,调节大、中、小气道阻力，而且对人体的免疫功能具有双向调节作用〔15〕。

Yamaguchi等〔16〕研究发现针刺中医经穴能上调正常成年人CD2+、CD4+、CD8+等细胞及IL-4，IL-1β和IFN-γ的水平。本实验中选取肺俞和足三里穴进行针刺，因为中医理论认为，肺俞穴是足太阳膀胱经的重要穴位，是肺的“背俞穴”，肺俞穴为肺气所输注的部位，能疏泄肺气，又是肺脏气血在背部的反映点,可以接受针灸刺激，并通过其经络系统，对肺脏气血起调节作用，损有余而补不足，使人体气血阴阳维持动态平衡。针灸肺俞穴可明显提高健康人的用力肺活量。该穴不仅是临床治疗和研究中应用最广泛的穴位，也是目前基础研究针灸调节肺脏功能的常用穴位。足三里穴是足阳明胃经之合穴,“胃者五脏六腑之海也。水谷皆入于胃，五脏六腑之气皆禀于胃”， 又脾胃互为表里，为后天之本，气血生化之源，是机体生命活动的基础。足三里穴为胃经之要穴，具有理脾胃、调气血、补虚弱、宣畅气机等诸多功效而倍受关注。大量的研究证实，针灸足三里穴具有良好的免疫调节作用，且这种作用具有整体性和双向性〔17〕，在呼吸系统疾病的研究中，发现针灸或穴位注射足三里穴均可使支气管哮喘者过低的CD8+细胞升高，使增大的CD4+/ CD8+细胞比值缩小，过高的IL-4和IgE降低，控制哮喘的发病〔18〕。本实验模型大鼠经针刺后，肺通气功能和肺病理得到一定程度的改善，且针刺能抑制Th1细胞，使Th1/Th2格局趋于平衡，且针刺7次即有调节作用。但针刺调节Th1/Th2似乎以肺为主，是否与肺的局部炎症反应有关，尚需进一步研究。

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