蛋白质组学技术在网络药理学中的应用

刘幸，周虎

(中国科学院上海药物研究所分析化学研究室，上海 201203)

蛋白质组学技术在网络药理学中的应用

刘幸，周虎*

(中国科学院上海药物研究所分析化学研究室，上海 201203)

蛋白质组学发展至今已日趋成熟，在生物医药相关领域研究中的应用显著增加，与之相关的样品制备技术、蛋白定量方法及先进的质谱仪器也得到了快速发展。网络药理学是近年来提出的新药发现新策略，是药理学的新兴分支学科，它从整体的角度探索药物与疾病的关联性，发现药物靶标，指导新药研发。将蛋白质组学技术应用于网络药理学研究，能使研究人员系统地预测和解释药物的作用，加速药物靶点的确认，从而设计多靶点药物或药物组合。综述了蛋白质组学技术的新近研究进展，并简单概述了其在网络药理学中的应用。

蛋白质组学；质谱技术；定量蛋白质组学；网络药理学

蛋白质组（proteome）由蛋白质（protein）与基因组（genome）这2个词结合而来，最早由澳大利亚学者Wilkins和Willian等人于1994年提出，是指基因组所表达的全部蛋白质。截至2012年，关于蛋白质组学研究方面的文献报道已经超过了20 000篇[1]。蛋白质组学研究是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，在很大程度上依赖于许多不同的技术，如样品制备、蛋白质的标记和定量，新的质谱技术、生物信息学等。与此同时，蛋白质组学研究在生物医药相关领域的应用也显著增加，蛋白质组学研究的新技术新方法也成功应用于网络药理学的研究中，推动了网络药理学的迅速发展。本文对蛋白质组学技术在网络药理学中的应用进展作一综述，旨在为其进一步研究提供参考。

1 蛋白质组学技术最近的发展

1.1 样品制备技术

样品制备是在“自下而上”的蛋白质组学（bottom-up proteomics）鉴定和定量研究中非常关键的环节。一般而言，蛋白质需要从细胞、组织或其他来源中提取出来，酶解成多肽片段后再进行质谱分析。因此，样品制备直接影响了鉴定到的蛋白质的种类和蛋白质定量的结果。

样品制备包括基于凝胶的技术（如传统的双向凝胶电泳）和近年发展的不依赖凝胶的方法（如多维蛋白质鉴定技术，MudPIT）。然而，到目前为止，科学家们发现不依赖凝胶的方法存在着耗时长、自动化难、灵敏度低和重复性较差等一系列缺点，并且疏水性蛋白质（如膜蛋白）、翻译后修饰蛋白、低丰度蛋白等具有特殊物化性质蛋白质的检测仍然是当前技术需要解决的重要挑战性问题。由于这些挑战的存在，因此很有必要发展新的技术方法，可以系统性整合蛋白质的提取、浓缩和分离等多个步骤。近来发明的一些新方法，如过滤器辅助样品制备（FASP）的方法和蛋白质组学反应器方法，为这个目标的实现铺平了道路。Wiśniewski等[2]发展了FASP方法制备样品，目前该方法已成为蛋白质组学研究中通用的样品制备方法。FASP方法的核心创新之处在于采用同一个过滤器（规格为过滤相对分子质量为10 000以下的物质的过滤器）来实现多种功能：去除去垢剂、小分子物质[如二硫苏糖醇（DTT）和碘代乙酰胺iodoacetamide（IAA）等]，进行缓冲液置换，去除用于酶切的胰蛋白水解酶和没有被酶切完全的蛋白或肽段等。已有文献报道，采用FASP结合强阴离子交换（strong anion exchange，SAX）分级分离的方法可以大大提高组织内膜蛋白的检出率和序列覆盖率[3]。FASP方法不但可以用于正常新鲜组织，还可以用于福尔马林固定和石蜡包埋的组织蛋白的翻译后修饰检测[4]。Ethier等[5]设计了一种整合简化样本处理流程的微流体装置，该装置被称为蛋白质组学反应器。其采用装填有强阳离子交换材料的微柱来处理样品，上样时蛋白质样品在低pH（pH＜3）条件下被酸化带上正电荷，紧紧吸附在反应器的强阳离子交换材料表面，而不带电的非离子型去垢剂因此能很容易被洗去。随后往反应器中加入DTT和IAA使蛋白质还原和烷基化，接着将反应器pH调至8，使加入的胰蛋白酶活性处于最佳状态。最后用HPLC-ES-MS/MS兼容的缓冲液洗脱酶切后得到多肽片段。笔者所在课题组进一步设计了结合台式离心机、更简便适用的蛋白组学反应器，称之为离心式蛋白质组学反应器，该法同样适用于临床组织样品的处理等。新样品制备技术的出现和不断发展为网络药理学的研究提供了强有力的工具[6]。

1.2 标记和非标记的定量蛋白质组学

蛋白质组学分析最初主要集中在蛋白质表达谱的研究上，当时的科学家们总是期望在双向凝胶电泳（2-DE）上能鉴定到尽可能多的蛋白质。经过进一步的发展，蛋白质组学研究开始重点检测鉴定具有显著生物学活性的蛋白质——生物标记物。定量蛋白质组学因此被认为是用于研究差异蛋白质的表达、寻找生物标记物的好方法。

根据定量方法的不同，定量蛋白质组学可以分为相对定量和绝对定量。相对定量方法（如SILAC和iTRAQ）用于比较不同样品中的相同蛋白质和多肽表达量的差异，而目标蛋白的绝对定量是通过引入带有同位素标记的合成肽作为内参而测定。

稳定同位素标记氨基酸的细胞培养方法（stable isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC）是近年来比较常用的相对定量蛋白质组学分析方法。该法是在细胞培养时掺入稳定同位素标记的氨基酸（一般主要为精氨酸和赖氨酸），可实现接近100%的标记效率，通过比较基于质谱的2种或3种细胞样品中已标记和未标记蛋白质的相对丰度，能比较容易得到定量数据，发现生物标记物[7]。由于组织样品的复杂性，采用传统的单细胞系SILAC方法不适用于组织蛋白质组的分析，这一点在癌症的研究中尤为突出，因为长久以来一直未能找到能模拟肿瘤组织多样性的单细胞株模型。为了改进SILAC法，Geiger等[8]发明了一种称之为“spike-in”或“superSILAC”的方法，用于定量组织样品中的蛋白质组。他们选择了不同来源、不同发展阶段和包括多种分子标记物的细胞系作为内参，这些细胞系混合物被称为“superSILAC”混合物。与仅用单细胞株作为内参的方法比较，使用“superSILAC”混合物能提高蛋白质组学分析的精确度和重复性。

同位素相对标记与绝对定量技术（isobaric tagging for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是一种已经应用到培养的细胞、生物流体和组织等多种类型样品的后生物合成标记策略。该法采用不同质量的标签标记蛋白质和肽段，将这些标记片段混合后结合多维色谱分离和后续的串联质谱鉴定，从而实现对不同来源样品蛋白进行分离和鉴定的目的。iTRAQ技术也是蛋白质组学研究中用于定量蛋白质表达差异的一种广泛使用的方法，其最大的特点就是可以进行最多八重定量标记，能大大提高分析效率。最新的串联质谱标签技术（tandem mass tag，TMT）目前最多可以实现六重标记，加上高分辨质谱仪的使用[9]，规模化精确定量多种细胞状态下相同蛋白质的表达变化已经变成现实。

绝对定量方法是在样品中引入稳定同位素标记的合成肽段作为内参，基于内参的强度并采用质谱的选择反应监测模式（selected-reaction-monitoring，SRM）来检测和定量样品中蛋白质[10]。绝对定量方法能检测到蛋白质组的微小变化[11]，日益受到蛋白质组学研究的重视[12]。

基于质谱的定量蛋白质组学技术需要引入稳定同位素标记等各种标记，虽然这些方法仍在广泛使用，但它们受多种条件限制。首先是成本比较昂贵，其次是很多标记方法只能用于某些特定类型的生物样品。基于标记定量蛋白质组学的这些缺点，非标记定量蛋白质组学由此诞生并得到发展，在生物标记物的发现中成为一个非常重要的技术。

非标记定量蛋白质组学研究不需要在样品中引入任何标记，即将等量的样品分别用胰酶酶切后采用LC-MS分析采集每种样品的一级谱和二级谱，并采用不同的测量计算方法来鉴证各种不同的肽段序列特征。谱图计数（spectral counting）和多肽离子强度计数（intensity-based measurement）是基于质谱的非标记定量蛋白质组学的2种主要方法[13]。此外，还有最新发展的一种总蛋白质方法（the total protein approach）用于估算蛋白质的绝对拷贝数。每个细胞中的蛋白质拷贝数能从质谱数据中计算出来，主要是通过比较每种蛋白质的强度与蛋白质组总的质谱信号所得[14]。非标记定量方法不受样品来源和数量的限制，能适用于各种临床样品如组织和体液等。Mann实验室采用非标记定量技术开展配对的原发性结肠癌、淋巴转移癌和正常结肠组织的蛋白质组学研究，总共检测到8173个蛋白，其中有1808个蛋白的表达发生显著变化。他们的这项研究为癌症发生、发展过程的相关研究提供了新思路[14]。

1.3 先进的质谱技术

质谱鉴定、定量肽段和蛋白质在速度、灵敏度和准确度等方面均有一定优势，使其成为蛋白质组学研究中不可替代的工具。近年来生物质谱的飞速发展的原因主要是基质辅助激光解析离子化（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）和电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）这2种软电离技术的发明和发展。MALDI离子源一般结合飞行时间质谱TOF MS或者TOF/TOF MS。由于样品材料和所涉及样品表面的兼容性，MALDI MS已经直接用于组织成像。临床样本如组织切片可以直接置于试样靶上，加入基质覆盖切片，经MALDI离子化后就可以用于质谱分析[15]。MALDI MS技术已经用于新鲜的以及甲醛固定、石蜡包埋等肿瘤组织的研究[16]。与MALDI MS相比，ESI MS联合液相色谱（LC-MS）则是分析复杂样品的一种更优方法。此外，还有高分辨率质谱结合ESI，其中用于蛋白质组学研究的主要是QTOF和Orbitrap[11]。随着蛋白质组学技术的发展，科学家们开始追求更高分辨率和更高速率的质谱。Orbitrap Elite和Q Exactive是Orbitrap家族的新成员，它们的分辨率分别达到了240 000和140 000[17-18]。除了提供无与伦比的高分辨率，Orbitrap Elite还提供了多种裂解方法，例如碰撞诱导解离、高能碰撞解离和电子转移解离等，这些方法能大大提高从MS/MS中获得的信息，尤其有利于修饰肽的检测。Ahlf等[19]应用Orbitrap Elite进行“自上而下”的蛋白质组学（top-down proteomics）分析，并设计了一种在高分辨率时提高分离度的方法。Q Exactive台式Orbitrap系统将高性能四级杆母离子选择与高分辨率、精确质量Orbitrap检测相结合，能够鉴定、定量分析和验证复杂体系中更低痕量水平的蛋白、肽和代谢物，扩大了可用于蛋白质组学研究的领域。通过结合Q Exactive系统与纳升高效液相色谱仪（nano UHPLC），Nagaraj等[20]开发了一种用于检测酵母蛋白质组的分析方法。他们鉴定的蛋白质超过了4000种，几乎覆盖了酵母细胞内所表达的全部蛋白质。如上所述，更高扫描速率和更高分辨率已经成为质谱仪器发展的重要目标。传统的QTOF和Orbitrap的扫描频率一般低于50Hz，最近新开发的Triple TOF已经达到100Hz的扫描速率，并用于肽段和蛋白质的鉴定中[21]。运行在Triple TOF上的一种称为SWATH的蛋白质组学研究方法随之开发出来，SWATH首次采用非数据依赖（data-independent）的MS/MS采集方法，能够系统性地生成完全的、高特异性的碎片离子全貌图。该技术能够针对监控范围内的所有母离子产生特异性碎片离子数据。不同于传统的采集方法，该技术不依赖于检测到的母离子质量来触发MS/MS采集，而是通过快速移动的选择窗口将样品中的所有组分系统性地全部打成碎片。采用SWATH获得的数据表明该技术能提供完整的样品定量与定性结果，是蛋白质组学研究中一种极具前景的突破性方法[22]。

2 网络药理学的产生

关于药物与疾病关系常见的比喻是钥匙与锁的关系，即一把钥匙特异性地打开一把锁。在过去的20年里，药物研发的主导思想是设计高选择性配体药物以避免不必要的副作用。然而，后基因组生物学结果却越来越多地表明药物作用的复杂性。Yildirim等[23]对现有药物及其靶点的相互作用情况进行了分析，发现很多结构不同的药物可以作用于相同的药物靶点，他们还发现大部分药物都有若干个靶点，有些药物甚至靶点较多。Yildirim等的这些研究结果表明药物与靶标相互作用的新局面：多把钥匙能开同一把锁和一把钥匙能开多把锁，且后者比前者更常见。此外，研究者们采用模式生物及大规模的功能基因组研究发现具有治疗价值的可敲除的单基因数不超过总基因数的10%[24-25]。对于复杂疾病，如肿瘤、心血管疾病、糖尿病及神经性疾病等，仅使用针对单一分子靶点的高特异性化合物来治疗很难获得很好的疗效。另一方面，近年来的新药研发面临巨大的困境：在过去的10多年中，候选新药转化成临床有效新药的速率显著下降，而在Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中因缺乏有效性和出现非预期的毒性所导致的损耗呈现令人担忧的增长趋势，约占研发失败原因的60%[26]。新药研发后期失败的比率增高与疾病相关单靶点高选择性药物设计的主导思想密切相关。因此，基于“一个基因，一种药物，一种疾病”的药物研发模式遇到了挑战，已经显示出其发展的局限性。英国药理学家Hopkins[27-28]独具见解性地指出，造成药物研发失败的主要原因可能并不是技术和环境条件，或者甚至也不是科学的因素，而是哲学上的原因。他率先提出了“网络药理学”的概念，从新的角度认识药物作用机制，为以新的策略研发新药提供新的思想、理论及方法。

网络药理学是在系统生物学和多向药理学快速发展的基础上提出的药物设计新方法和新策略，即将生物学网络与药物作用网络整合，分析药物在网络中与节点或网络模块的关系，由寻找单一靶点转向综合网络分析[27,29]。因此，网络药理学与网络生物学、多向药理学、功能基因组学、蛋白质组学等新兴学科的发展密切相关。

3 蛋白质组学在网络药理学中的应用

网络药理学目前的研究思路主要有2种：一种是根据公共数据和公开发表的已有数据，建立特定疾病及其防治药物靶点预测网络模型，预测所研究药物的作用靶点，进而构建所研究药物-靶点-疾病网络，解析所研究药物的网络药理学机制，并通过相应的实验进行机制的验证；另一种是利用组学技术及高通量技术，观察药物对模型（细胞和动物）的作用或模型对药物的作用，针对所产生的大量数据，采用生物信息学的手段分析和构建药物-靶点-疾病网络，进而解析在研药物的网络药理学机制。下面主要就蛋白质组学在网络药理学中的应用进行简单介绍。

3.1 药物作用靶点相关蛋白质的寻找

大部分小分子药物和生物制剂主要作用于蛋白质，这些蛋白质并非孤立存在，而是被嵌入在细胞信号通路和网络中，因而在生理和功能上与其他蛋白质和细胞成分等紧密联系在一起。另外，几百种不同类型的细胞组成了人体的器官，这些蛋白质存在于各种不同器官等生理环境之下，药物可能产生与预期相同或不同的作用[30]。鉴于这种复杂性，研究者们运用蛋白质组学技术来鉴定靶标蛋白质和脱靶（off-targets）蛋白质，并从药物作用后所观察到的表型中揭示药物所产生的作用机制[31]。在网络药理学中，蛋白质组学技术已被用于确定有生物活性的小分子化合物及其类似物的特异性，利用这些小分子探针预测可以结合的蛋白质靶点，或者发现某些未知的靶点。更为重要的是，这些未知的蛋白质靶点即脱靶蛋白可能是附加的成药靶标，也可能是引起副作用和毒性的根本原因。蛋白质组学技术在网络药理学的“寻找高效的多靶点药物，发挥药物最大的临床疗效，将副反应和毒性降到最低”的研究中起到了非常关键的作用。

Ramachandran等[32]采用iTRAQ技术对人神经SHSY5Y细胞模型中受到中药天麻调控的因子进行定量表达谱检测，共鉴定出2390种蛋白，其中406种蛋白具有显著表达差异，包括288种上调蛋白和118种下调蛋白。进一步研究结果表明，天麻促进神经再生信号级联放大可能是通过以下途径实现的：控制伴侣蛋白/蛋白酶降解途径，刺激神经保护基因通过不同的再生形态和与神经突触可塑性相关的能力来调控其他蛋白。由于天麻对神经的潜在保护作用是近年来新的研究热点，其具体的作用靶点还有待确证，该研究为解释天麻的神经保护活性作出了一定的贡献。

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其治疗费非常高昂。石杉碱甲已被证明对阿尔茨海默病具有多种神经保护作用，但其具体的作用靶点和药理学作用机制仍然不清楚。笔者所在团队建立了离心式蛋白质组反应器技术，开展了石杉碱甲对神经细胞保护作用机制的非标记定量蛋白质组学研究工作[33]。石杉碱甲加药组（10 μmol·L-1石杉碱甲预处理2 h，再以5μmol·L-1Aβ寡聚体处理24 h）和Aβ寡聚体对照组（5μmol·L-1Aβ寡聚体处理24 h）样品的5次生物学重复，组内和组间样品均具有高重复性。实验共鉴定和定量了2860种蛋白质，其中196种蛋白质在石杉碱甲加药与对照组间存在统计学差异（P＜0.05）。通过对这些显著变化的蛋白质进行KEGG信号通路分析，我们发现阿尔茨海默病信号通路中的蛋白质存在变化，其中Tau蛋白在石杉碱甲加药组有下调。通过Ingenuity Pathway Analysis软件分析，p53及其相互作用网络的蛋白质绝大多数在石杉碱甲处理时下调。Western Blot验证表明石杉碱甲可通过下调p53的表达来减弱Aβ寡聚对Neuro2A细胞的损伤。

中药双龙方是由人参、丹参组成的中药复方制剂，具有益气养血、活血通脉的功能，适用于冠心病以及心绞痛、心肌梗死的治疗。当其与自体骨髓单个核细胞[主要含骨髓间充质干细胞（MSC）]移植合用时，可促进移植细胞在心肌的生存，产生大量新生的心肌细胞及心肌小血管，促进病变的修复，但其作用的分子机制依然不清楚。Fan等[34]采用比较蛋白质组学的方法研究大鼠的MSC与心肌样细胞的蛋白质表达情况，他们同时采用免疫荧光法分析了不同处理组MSC向心肌细胞的分化情况。研究结果表明，双龙方能够诱导MSC向心肌细胞的分化并促进心肌特异性蛋白的表达，其中有大约36种蛋白表达发生显著差异，它们主要为细胞骨架、能量代谢和信号转导相关的蛋白质。这些受到双龙方调控的蛋白质的差异表达，可能通过不同的信号通路在大鼠的MSC分化过程中起到了非常关键的作用。这项研究为双龙方治疗心肌梗死的显著疗效提供了一些例证，其作用的靶点需要更为深入的研究。

Wnt/β-catenin信号通路涉及一系列发育过程，在细胞分化、增殖和凋亡等过程中起到重要作用，该途径的异常激活可导致多种癌症。然而，当前的癌症治疗中几乎没有靶向于该通路的抑制剂。Huang等[35]运用iTRAQ方法研究证明活性小分子化合物XAV939能选择性抑制β-catenin介导的转录。有意思的是，XAV939也能抑制聚腺苷二磷酸核糖激酶（poly-adenosine diphosphateribosylating enzymes），亦即端锚聚合酶tankyrase 1和tankyrase 2，它们与轴蛋白（Axin）的高度保守区发生作用，并通过泛素-蛋白酶体途径刺激其降解。因此，XAV939不仅是用于研究β-catenin信号通路的有用工具，也是一种Wnt/β-catenin和端粒治疗的潜在药物。

3.2 与耐药性相关的蛋白质的寻找

近年来在癌症、感染性疾病等的治疗过程中遇到的最大挑战之一是治疗过程中机体耐药性的产生。化疗药物或抗生素等常可诱导细胞调控网络和信号转导途径等发生适应性变化，从而导致机体耐药性的产生。机体的耐药性能由最开始的只能抵抗一种药物发展到交叉抵抗一些结构、功能皆不相同的药物即“多重耐药性”。如上所述，网络药理学的研究内容之一是从整体网络的角度认识药物的作用机制，能更好地了解抗性机制，并能确定一些能干预治疗、阻止耐药性产生的新靶标蛋白。蛋白质组学方法在这个过程中无疑是最有效的研究手段，它能较全面地鉴定出与耐药性产生相关的个别蛋白质及信号通路。通过阻断这些蛋白质或信号通路，可以使耐药组织或细胞重新恢复对原来所使用药物的敏感型，甚至可以帮助消除其他一些药物的抗药性。更重要的是，用蛋白质组学方法表征1个耐药性表型可提供1个更加完整的功能调控和信号转导途径发生适应性变化的图片，从而为组合多个药物靶点的治疗方案提供依据，能有效解决该治疗方案的耐药性问题，实现疾病治疗良好的预后[31]。

3.2.1 肿瘤治疗过程中的耐药性研究 Van Houdt等[36]采用非标记定量方法比较化疗耐药性的结肠癌干细胞和化疗敏感性的已分化的结肠癌细胞的蛋白质表达差异。该研究总共鉴定到3048个蛋白，其中有32个蛋白在结肠癌干细胞中的表达量至少是已分化细胞中的2倍以上。信号通路研究表明调控“细胞死亡”的蛋白在2种类型细胞中有显著表达差异。有意思的是，表达上调量最高的1个蛋白是人杆状病毒IAP（inhibitor of apoptosis protein，IAP）重复包含蛋白6（baculoviral IAP repeat-containing protein 6，BIRC6），它是杆状病毒细胞凋亡抑制蛋白IAP家族的成员之一，可能在结肠癌干细胞抵抗化疗的过程中起关键作用。他们进一步将该基因敲除后，发现结肠癌干细胞对化疗药物如奥沙利铂（oxaliplatin）和顺铂（cisplatin）变得十分敏感。这项蛋白质组学研究结果表明BIRC6能作为根除结肠癌干细胞，从而抑制结肠癌复发的1个潜在的治疗靶点。Zhao等[37]采用iTRAQ的方法分析比较了多西他赛（docetaxel）敏感型PC3细胞和多西他赛耐药型PC3-Rx细胞蛋白的表达情况，并采用重组蛋白过表达实验和siRNA敲除实验进行功能学验证。这项研究结果表明巨噬细胞抑制因子1（macrophage inhibitory cytokine 1，MIC1）能作为多西他赛治疗过程中获得型耐药性的一个潜在的生物标记物和治疗靶点。Patel等[38]采用2DE-MS的方法研究发现，抑制素1（prohibitin 1，PHB1）和谷胱甘肽-S-转移酶π（glutathione S-transferase pi，GSTπ）表达水平的升高与紫杉醇（paclitaxel）耐药性相关。免疫荧光染色和分级研究显示耐药性细胞系表面PHB1的表达增加。在抗紫杉醇的肿瘤细胞中利用siRNA短暂性地沉默PHB1或者GSTπ后，这些细胞能部分恢复对紫杉醇的敏感性。有意思的是，沉默PHB1，但不沉默GSTπ，紫杉醇作用后诱导启动细胞的内在凋亡途径。同样地，永久性地敲除PHB1或者GSTπ能显著增加肺癌A549细胞对紫杉醇的敏感性。这项研究表明PHB1介导了肿瘤细胞对紫杉醇的耐药性，而PHB1的这种作用可能取决于其在细胞上的定位。根据这些初步的功能研究，PHB1可能作为肿瘤耐药性治疗的潜在靶点。Tilghman等[39]采用TMT标记的定量蛋白质组学方法比较了来曲唑（letrozole）耐药型和敏感型的MCF-7细胞的蛋白表达谱，该细胞已过表达了芳香化酶（aromatase）。这项研究鉴定出fascin比其他显著上调的蛋白质更加具有潜力作为抑制激素抵抗的乳腺癌细胞转移的治疗靶点。当然，上述这些蛋白质在被证明是可能的药物靶点之前需要进行更广泛的功能学研究和验证。

3.2.2 致病菌耐药性研究 Rao等[40]展开了对革兰阳性土壤细菌天蓝色链霉菌抵抗第2代喹诺酮类抗菌药物环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）耐药机制的研究，该菌对CIP的耐药性并不是后天获得性的，而是与生俱来的。他们采用2-DE联合MALDI-TOF/TOF的方法比较了处于亚致死浓度的CIP生长环境中的细菌与处于正常生长环境的细菌中蛋白表达情况，鉴定到24个有显著表达差异的蛋白质。其中一些下调蛋白参与碳水化合物的代谢途径，表明细菌由正常生理状态转向降低或关闭新陈代谢的状态；另外一些下调蛋白参与转录和翻译过程，同时伴随着氨基酸合成和蛋白质折叠过程中的一些酶的表达明显下降，这些可能是CIP损伤DNA后细菌作出的适应性反应，从而最大限度地减少代谢过程中的能量浪费，确保细菌能在长期恶劣的条件下生存。Kumar等[41]采用蛋白质组学技术研究了结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素和丁胺卡那霉素的耐药性，在鉴定到的差异蛋白中，他们研究发现了几种与铁的调节和铁代谢相关的蛋白，指出铁可能在结核分枝杆菌抵抗二线药物的过程中起到了非常关键的作用。

4 展望

网络药理学作为药理学的一个新兴分支学科，为分析药物作用提供了全新的视角。我们可以通过网络药理学的研究来寻找和确认靶点，对新药的发现具有指导意义。将蛋白质组学技术应用于网络药理学的研究中，能比较直观地看到药物在蛋白质水平上所起到的调控作用，并能建立一个较全面的药物-蛋白质相互作用网络，为多靶点药物的开发提供切实有效的途径。本文综述了一些将蛋白质组学技术应用于网络药理学的成功实例和目前的一些研究思路。随着蛋白质组学自身技术的飞速发展，其在网络药理学研究中一定会有更广泛的用途。但需要指出的是，蛋白质组学只是网络药理学的组成部分之一，网络药理学的发展不仅需要蛋白质组学的发展，还需要依赖其他组学（如基因组学、代谢组学等）及其他相关学科如生物信息学、系统生物学、计算生物学、多向药理学等技术的发展。只有很好地融合了这些技术，才能真正发挥网络药理学的药物研发新模式的作用，真正为复杂疾病的治疗带来重大突破。

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[专家介绍] 周虎：博士。2001年毕业于南开大学，获得生物学专业学士学位。同年进入上海生物化学与细胞生物学研究所，于2007年获得生物化学与细胞生物学专业博士学位。在2008年3月加入渥太华大学系统生物研究所开展博士后研究工作，并于2009年起担任质谱实验室主管。2012年作为中国科学院“百人计划”入选者加入上海药物研究所分析化学研究室，并担任质谱组课题组长。研究方向为质谱方法学、有机小分子和生物大分子相互作用以及转化医学相关的蛋白质组学，以寻找药物小分子的作用靶点及其作用机制。已在国外学术刊物上发表SCI收录论文44篇，其中作为第一作者的论文11篇，通讯作者2篇。2009年获得第21届国际生物化学与分子生物学联盟学术大会青年科学家论坛（IUBMB YSP）资助；2010年至今获得加拿大健康研究院（CIHR）神经退行性脂组学博士后基金资助；2012年获中国科学院“百人计划”资助。2012年获加拿大渥太华大学“International Research Acceleration Program”资助。

周虎本人一直从事液相色谱-质谱联用方法学和疾病相关的蛋白质组学的研究，开发了一系列新的液相色谱-质谱联用的方法，包括：基于pH梯度洗脱的强阳离子交换液相色谱-质谱联用的方法，以及可以分析人类血浆中糖蛋白的糖蛋白质组反应器（glycoproteomic reactor）和用于膜蛋白分析的离心式蛋白质组反应器等。相关论文已经发表在“Mol Cell Proteomics”和“J Proteome Res”等杂志上。课题组现在将蛋白质组学技术应用于网络药理学研究中，如第一次采用定量蛋白质组学技术对石杉碱甲处理前后的神经元细胞进行分析，发现石杉碱甲能通过下调p53及其相互作用蛋白质水平来实现其神经元保护作用，相关研究成果已发表在“Proteomics”杂志上。

Application of Proteomics Technique in Study of Network Pharmacology

LIU Xing, ZHOU Hu
(Department of Analytical Chemistry, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

Proteomics has become more and more mature. Its application in biomedical fields has increased significantly, and the related sample preparation techniques,protein quantification methods and advanced mass spectrometry technique have also been developed rapidly.Network pharmacology is an emerging area of pharmacology which explores the relevance between drugs and diseases from an overall perspective. Network pharmacology offers a new framework for thinking about how to innovate drug discovery. Applying proteomic approaches into network pharmacology research, can help researchers to predict and understand the mechanisms underlying the multiple actions of drugs. It can also uncover multiple drug targets for combinatorial therapeutic solutions or for designing and optimizing multitarget drugs. In this paper, the recent technological developments in proteomics were reviewed, and current proteomics-based research on network pharmacology was briefly summarized.

proteomics; mass spectrometry technique; quantitative proteomics; network pharmacology

Q591

A

1001-5094(2014)02-0089-08

*接受日期：2013-12-27

周虎，研究员，中国科学院“百人计划”入选者；

研究方向：质谱方法学、有机小分子和生物大分子相互作用以及转化 医学相关的蛋白质组学；

Tel：021-50806706；E-mail：zhouhu@simm.ac.cn