海南美登木对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

宫爱民 杨世忠 冯 钊 许朝霞 燕海霞

(海南医学院中医学院中医内科，海南 海口 571101)

原发性肝癌居我国癌症发病率的第3位，死亡率的第2位，广西、海南等偏远落后地区发病率偏高〔1〕。据统计〔2〕，中国80%的肝癌患者在不同时间段、不同程度接受中医药的治疗，中药在治疗肝癌方面由于其疗效肯定、副作用少、费用低等优点，越来越受到国内外学者的重视。美登木属(Maytenus)植物主产于热带及亚热带地区〔3〕，海南美登木(M.Hainanensis)性辛、苦、温，归肝经，具有活血消癥功效，是临床上用于治疗肝癌的有效海南民族中草药，自20世纪70年代开始，国内外学者相继从美登木属植物中分离提取到美登素、美登普林和美登布丁等抗肿瘤活性成分，并通过多年的实验研究及临床应用，证明其抗实验动物瘤谱广、有效剂量低、安全系数大，临床实验的结果表明美登木属植物可治疗肝癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤〔4,5〕。民间广泛用作抗肿瘤的药物〔6,7〕，有研究表明，肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞的凋亡有密切关系，通过诱导癌细胞凋亡来治疗各种恶性肿瘤是目前研究的热点〔8〕。文献〔9,10〕研究表明：活血消癥中药抗肿瘤作用亦多从凋亡途径进行深入研究。本研究观察海南美登木含提取物对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响和治疗肝癌的作用机制。

1 材料和方法

1.1材料 海南美登木，产地海南，购自万宁药用植物研究所。人源肝癌细胞HepG2，上海中医药大学肝病研究所赠予；哈尔滨医科大学病理生理实验室保存。光学成像显微镜 (上海光学仪器厂)；超净工作台 (苏州安泰空气技术公司)；MCO-17AICO2培养箱(日本SANYO公司)；倒置显微镜 (上海光学仪器厂)；酶标仪(DG3022A日本产)；旋转蒸发器(DF-101S上海予正仪器设备有限公司)；多功能细胞分析系统(Becton Dickinson FACSort美国产)；纯水机 (SYJ-6HD，400GHL深圳产)；荧光显微镜 (德国 Leica 公司)。优等胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI-1640(美国Gibco公司)；DMSO、MTT测定试剂盒、Hoechst33258 荧光染料、碘化丙啶 (美国Sigma公司 )；EDTA(乙二胺四乙酸二钠)(上海信然生物科技有限公司)等。

1.2海南美登木提取物制备 用12、10、8倍量的水分别提取20 g药物1.5、1、1 h，合并过滤后的滤液，95%乙醇加入，使乙醇含量达80%，弃去放置过夜的上清液，冷冻干燥所收集的沉淀，制成冻干粉〔2,8〕。

1.3细胞培养 在含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中(含100 U/L青霉素和100 μg/ml链霉素)培养HepG2细胞，37℃恒温、5%CO2的细胞培养箱中2～3 d，消化传代1次，用于实验的为对数生长期细胞。

1.4海南美登木提取物的配制 称10 mg海南美登木提取物冻干粉,1 ml DMSO溶解，微孔0.22 μm滤器过滤，配制成10 000 μg/ml浓度的母液，生理盐水稀释成浓度为800、600、400、200、100 μg/ml的溶液。

1.5Hoechst33258荧光染色爬片实验 0.25%胰酶消化对数生长期的人肝癌HepG2细胞后制成5×104个/ml的细胞悬液，于6孔板中放入灭菌的盖玻片后加入200 μl/孔细胞悬液(加入细胞悬液前，可从盖玻片侧面轻轻吹进少量培养基，使盖玻片和孔板底部贴合较紧密后，再加入细胞悬液，防止细胞爬片时，爬到盖玻片背面)，于培养箱内培养12 h之后，取出培养板加入海南美登木提取物 0、 10、40 μg/ml(每个浓度设两个平行)，培养 24 h，吸掉孔板中的培养基后95%乙醇固定30 min，取出盖玻片，用PBS液冲洗2遍，放到载玻片上，用移液枪吸取少量配制好的5 μg/ml Hoechst 33258滴于盖玻片上，4℃ 避光染色15 min。PBS液冲洗2遍染色后的盖玻片，滴1滴甘油在盖玻片正面，将盖玻片反扣于载玻片上在荧光显微镜下观察细胞形态。

1.6MTT法检测海南美登木提取物对肝癌HepG2细胞生长的影响〔1〕0.25%胰酶消化对数生长期的人肝癌HepG2细胞后，用RPMI1640 完全培养液(含10%灭活小牛血清 )将细胞制成2.0×104个/ml的细胞悬液，加入96孔培养板内，180 μl /孔，培养箱内培养 12 h，分别加入不同浓度海南美登木提取物溶液20 μl于贴壁生长细胞中，分别达到80、60、40、20、10 μg/ml的药物终浓度，加入20 μl RPMI1640 完全培养液为阴性对照组，180 μl RPMI1640 完 全培养液+20 μl生理盐水为空白对照组，每组4个平行孔，培养箱中培养细胞24、48及72 h后，倒置显微镜观察药物作用于肿瘤细胞后对其形态的影响，20 μl 5 mg/ml MTT溶液加入每孔后培养箱内继续培养4 h，孔中培养液以翻板法弃去，加入150 μl DMSO，恒温振荡器(30℃)上避光摇匀10 min，492 nm 酶标仪测定各孔光密度值(OD)。按公式计算各时间点的IC50及细胞抑制率。抑制率(%)=(阴性对照组OD值-实验组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)×100。

1.7流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 将HepG2细胞悬液按每孔1×104个细胞接种于6孔板，培养至对数生长期，分别用 0、20、60 μg/ml 的海南美登木提取物处理24 h，冷PBS洗收集的细胞2次，4℃冰箱中70%冷乙醇固定过夜。PBS洗固定后的细胞1次，5 000 r/min离心 5 min，0.3 ml PBS中重悬细胞，加入0.6 ml碘化丙啶溶液，避光染色4℃ 15 min，50 μm尼龙网过滤后，用流式细胞仪检测有无凋亡峰，分析细胞周期。同样调整HepG2细胞浓度 为1×104，种于 6 孔板 中，至对数生长期，分别用海南美登木提取物 0、20、60 μg/ml处理24 h，收集细胞，加入 5 L FITC Annexin V 和 5 L PI，轻微振荡，室温下(25℃)避光孵育15 min，加入400 μl 1×结合缓冲液，流式细胞仪检测活细胞、坏死细胞、早期凋亡、晚期凋亡细胞百分比，计算凋亡率。

1.8统计学方法 使用SPSS15.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1海南美登木提取物对肝癌HepG2细胞的增殖影响 人肝癌HepG2细胞分别与不同浓度的海南美登木提取物作用24、48、72 h 后，呈时间和浓度依赖性作用于细胞增殖的抑制率均明显高于阴性对照组 (P<0.01)，IC50值分别是24 h(32±1.06),48 h(57±0.148)、72 h(26 .95± 2.96)。

2.2药物作用于肿瘤细胞后Hoechst33528 荧光染色显示的形态变化 阴性对照组呈核均匀的圆形浅蓝色细胞，10 μg/ml药物处理组细胞呈核质固缩、体积缩小状态，80 μg/ml药物处理组核碎裂，核质明显固缩，细胞皱缩，凋亡小体形成，为凋亡变化典型状态。

2.3药物作用于HepG2细胞后对其形态的影响 细胞旺盛生长，呈贴壁上皮样，细胞呈扁平延展、细胞间连接紧密，细胞质均匀而透明，为阴性对照组表现。药物处理后减少了肿瘤细胞的数量，且细胞脱壁漂浮，细胞间呈疏松连接，增强了细胞轮廓，呈变圆皱缩的表面状态，细胞数量减少及形态变化与药物呈浓度依赖性。

2.4海南美登木提取物对人肝癌HepG2细胞周期的影响 与0 μmol/L组比较， G0/G1期细胞比例在药物处理组明显降低 (P<0.01)；细胞G2/M期比例则明显增加 (P<0.01)，S期细胞无明显变化 (P>0.05)，各药物处理组均可观察到呈浓度依赖性的凋亡峰，见表1。

2.5海南美登木提取物对人肝癌 H ePG 细胞凋亡的影响 与0 μmol/L组相比，药物处理组细胞凋亡率明显呈浓度依赖性增加 (P

表1 海南美登木提取物对人肝癌HepG2细胞周期比例及凋亡率±s,%)

3 讨 论

肝切除及肝移植是肝癌首选的治疗方法，但其受到很多因素的制约。化疗对肝癌效果不佳，其毒副作用使其广泛应用受到很大的限制。新的分子靶向药物索拉非尼虽然可以延缓肿瘤进展，能一定程度上延长生存期，但该药物价格较为昂贵，出现较严重不良反应，效果还需进一步评价。海南美登木提取物具有很多生物活性，如增强免疫等。本实验结果表明海南美登木提取物呈时间、浓度依赖性显著抑制HepG2肝癌细胞的增殖。肿瘤细胞的增殖生长周期被海南美登木提取物改变，肿瘤细胞阻滞在G2期，因而抑制了肿瘤细胞的增殖。海南美登木提取物对肝癌细胞具有良好的凋亡诱导作用。

4 参考文献

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