天王补心汤、六味地黄汤治疗血管性痴呆小鼠的疗效对比

刘丰熙 牛 凯 李 炜 薛贵平 王 树 张丹参

(河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

血管性痴呆(VD)占全部老年痴呆的35.8%～39%，是仅次于阿尔茨海默病(AD)的第二大痴呆病因。VD属于中医的 “痴呆”、“呆症”、“健忘”等的范畴〔1〕，病位在脑，与心和肾的关系密切。目前对于中药复方治疗VD的实验研究报道不多，对比其治疗效果的研究更少。李东腾等〔2〕曾做过天王补心丹改善记忆的研究，冯炯等〔3〕曾做过六味地黄丸改善SAMP8小鼠的学习记忆的研究。本实验从补心、补肾治疗角度入手，选择补益心血的代表方天王补心汤、补益肾精的代表方六味地黄汤作为研究对象，通过对VD治疗效果的互相比较研究，找出治疗VD的较佳方药。

1 材料与方法

1.1动物 健康昆明种小鼠，体重(28±2)g，均为雄性，由中国医学科学院药物研究所动物实验中心提供。全部动物在实验室适应性饲养3 d后用于实验，分笼饲养，自由饮食和饮水。室温(20±2)℃。

1.2主要药品、试剂 天王补心汤：酸枣仁、柏子仁、当归、天冬、麦冬、生地、人参、丹参、玄参、白茯苓、远志、桔梗；六味地黄汤：熟地、山萸肉、山药、泽泻、丹皮、茯苓；均购自张家口市华佗药房，药液先按照临床用药煎煮方法熬制成常规药液。脑复康：购自石家庄市华新制药厂，批号N091203。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒：南京建成生物工程研究所。3.5%水合氯醛、液体石蜡、生理盐水(NS)、肝素、0.025 mmol/L氯化钙、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。

1.3仪器 SBA-2程控避暗箱：中国医学科学院药物研究所。XTY-2探索运动试验仪：中国医学科学院药物研究所。STT-2跳台仪：中国医学科学院药物研究所。LabTech紫外可见分光光度计UA-2100：北京莱博泰科仪器有限公司。Sigma-3k30：高速冷冻离心机：美国Sigma公司。BT224S电子天平：德国Sartorius公司。1512型石蜡切片机：西德莱卡公司。TS-12E自动脱水机：湖北孝感电子仪器厂。LKB NovaIV超薄切片机：瑞典LKB公司。显微镜：YM200，日本OLYMPUS。

1.4方法

1.4.1实验分组 随机分为正常组、假手术组、模型组、脑复康组、六味地黄汤组、天王补心汤组，每组15只。

1.4.2模型制备与给药方法 在Himori法〔4〕基础上进行改进。3.5%水合氯醛(10 ml/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，仰卧位固定，自胸骨柄到下颌骨间行5～8 mm正中纵向切口，分离两侧颈总动脉，分离后用液体石蜡浸泡过的黑色手术线穿过左右二侧颈总动脉，尽量恢复两侧颈总动脉到原位，在气管上方轻轻将黑色手术线打一松的反手结，结的松紧以不压迫气管为宜。在每侧颈总动脉上方的黑线上穿过一条用液体石蜡浸泡过的白色手术线，按Himori法埋线后缝合切口。术后48 h将颈下部黑色手术线拉紧，阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态， 5 min后轻拉两侧白色手术线，使颈总动脉恢复血液再灌注。术后各组动物均灌胃给药，给药标准为20 ml/kg，六味地黄汤组、天王补心汤组、脑复康组小鼠每日早7:00给药，1次/d；正常组、假手术组、模型组每日早7:00给予等量蒸馏水，1次/d；共给药14 d。

1.5行为学实验〔5〕

1.5.1避暗实验 给药后1 h进行避暗实验，实验分为训练和测试，训练前将小鼠放入避暗箱内适应3 min，然后将小鼠背向洞口放入明室，同时启动自动记录装置，由于小鼠具有嗜暗习性，易进入暗室，进入暗室后由于受到电击迅速逃离暗室。在5 min内经多次电击，小鼠形成记忆，记录24 h后测验时3 min内小鼠受到电击的次数(错误次数)以及首次犯错误的时间(逃避潜伏期)。

1.5.2跳台实验 给药后1 h进行跳台实验，先将小鼠放入反应箱内适应 3 min，然后立即通以36 V的交流电，动物受到电击，其逃避反应即为跳上平台，部分动物会再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台，如此训练 3 min。24 h后，在底部铜栅通电的情况下，直接将小鼠轻轻置于平台上，记录从小鼠被放至平台到第一次跳下的时间，即潜伏期；同时记录 3 min内小鼠跳下平台的次数，即错误次数。

1.5.3探索实验 给药后1 h进行探索实验，首先将小鼠放在前面的明室中，点击实验开始，同时打开箱门，当小鼠钻进暗室时，则关上门断其后路。记录小鼠到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间;小鼠在暗室滞留时间、小鼠在明室滞留时间、小鼠爬高端的次数。

1.6小鼠脑组织生化指标的测定

1.6.1脑组织匀浆的制备 按照文献方法〔6，7〕，行为学实验结束后，将小鼠迅速断头处死，在生理盐水冰块上迅速打开颅骨取脑，将脑膜和小脑剥离，保留大脑，用冷生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干表面的水分，称重，放入干燥的玻璃器皿中，加入9倍重量的4℃生理盐水，用内切式组织匀浆机匀浆，转速10 000～15 000 r/min，每次匀浆10 s，间隔30 s，连续3～5次，即可制成10%脑匀浆，以3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

1.6.2小鼠脑组织内SOD，丙二醛(MDA)含量测定 取按照1.6.1方法制备好的脑匀浆上清液适量，按照SOD，MDA试剂盒说明书测定，计算小鼠脑组织SOD，MDA含量。

1.7病理实验 神经行为测试结束后，颈椎脱臼猝死，剥离颅骨至枕骨大孔以上，快速摘取全脑组织于冰皿上，迅速分离双侧大脑半球，取小鼠左侧大脑组织用10%甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡浸透、包埋后连续切片(厚度5 μm)，贴附于APES预处理过的载玻片上，常规HE染色，光镜下观察脑组织病理变化。

2 结 果

2.1六味地黄汤、天王补心汤对VD小鼠的神经行为学影响 在避暗试验中，与假手术组相比，模型组小鼠进入暗室潜伏期显著缩短(P<0.05)、错误次数显著增加(P<0.05)。与模型组相比，各治疗组进入暗室的潜伏期显著延长(P<0.05)、错误次数显著减少(P<0.05)。与脑复康组相比，六味地黄汤组和天王补心汤组小鼠进入暗室的错误次数显著减少(P<0.05)。见表1。在跳台实验中，与假手术组相比，模型组小鼠从平台跳下的潜伏期显著缩短(P<0.05)，犯错误次数显著增多(P<0.01)。与模型组相比，各治疗组小鼠从平台跳下的潜伏期显著延长(P<0.05，P<0.01)，犯错误次数显著减少(P<0.05，P<0.01)。与脑复康组相比，六味地黄汤组和天王补心汤组小鼠从平台跳下的潜伏期显著延长(P<0.05，P<0.01)；小鼠犯错误次数显著减少(P<0.05，P<0.01)。见表2。在探索实验中，与假手术组相比，模型组小鼠到达暗室、高端以及明室时间均明显延长(P<0.05)，爬高端的次数明显减少(P<0.05)，在暗和明室的滞留时间有明显差异(P<0.001)。与模型组相比，各治疗组小鼠到达暗室、高端以及明室的时间均明显缩短(P<0.05)，小鼠爬高端的次数明显增加(P<0.05)，在暗室和在明室的滞留时间无明显差异(P﹥0.05)。与脑复康组相比，六味地黄汤组和天王补心汤组小鼠到达暗室、高端和明室的时间明显缩短(P<0.05，P<0.01)；小鼠爬高端的次数明显增加(P<0.05)。见表3。脑复康、六味地黄汤和天王补心汤对小鼠被动回避学习记忆有改善作用，六味地黄汤和天王补心汤对小鼠被动回避学习记忆的改善作用综合优于脑复康，天王补心汤对小鼠被动回避学习记忆的改善作用最明显。

表1 六味地黄汤、天王补心汤对脑缺血再灌注小鼠避暗实验的影响±s，n=15)

2.2六味地黄汤、天王补心汤对模型小鼠脑组织内SOD、MDA的影响 与假手术组相比，模型组小鼠脑中SOD的含量均显著降低(P<0.01)，MDA含量显著增高(P<0.01)。与模型组相比，各治疗组小鼠脑中SOD的含量均显著增高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。与脑复康组相比，六味地黄汤组和天王补心汤组小鼠脑中SOD的含量均显著增高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)；其中，天王补心汤组小鼠脑中SOD的含量增高最明显，MDA含量降低最明显。

表2 六味地黄汤、天王补心汤对脑缺血再灌注小鼠跳台实验的影响±s，n=15)

2.3六味地黄汤和天王补心汤对模型组小鼠脑组织海马神经元形态影响 正常组和假手术组神经细胞排列紧密，层次分明，细胞结构清楚，细胞核及胞质清晰，尼氏体形态正常。模型组脑组织出现以神经细胞损伤、胶质细胞增生、血管壁增厚为特征的病变。海马区锥体神经细胞数目减少，排列层次减少，伴有片状软化灶；大部分细胞核固缩深染，尼氏体减少或消失，胞体肿胀，出现了大量的空泡区；海马内侧局部胶质细胞增多，部分区域血管壁增厚。脑复康组大部分海马锥体细胞恢复，排列较规整，部分细胞核固缩，散见有胶质细胞。尼氏体部分恢复正常，仅有小部分溶解。六味地黄汤组海马锥体细胞形态完好，排列整齐，但仍有少数细胞核固缩为三角形或多角形。尼氏体形态大致正常。天王补心汤组海马锥体细胞仅有少量脱失，细胞核仁清晰可见，胞质正常，仍可见少量胶质细胞。尼氏体大部分形态正常。

表3 六味地黄汤、天王补心汤对脑缺血再灌注小鼠在探索实验中认知探索功能的影响±s，n=15)

表4 六味地黄汤、天王补心汤对脑缺血再灌注小鼠脑中SOD、MDA含量的影响±s，n=15)

3 讨 论

六味地黄汤由宋朝的钱乙所创立，是滋补肾阴的经典方、代表方，由熟地24 g、山萸肉12 g、干山药12 g、泽泻9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g组成，原方用丸剂，本实验中为减小药物剂型之间的差异性，统一改为汤剂使用，其功效为滋阴补肾，用治肾祛诸证。方中熟地、山萸肉、山药三药相配伍，功能滋养肝脾肾，以补肾阴为主。天王补心丹出自于《摄生秘剖》，由酸枣仁、柏子仁等13味中药组成。全方共同起到滋阴养血、补心安神的作用，用于治疗心阴虚血少、神志不安证。

通过服用六味地黄汤，肾阴得到补充，阴精化生有源，脑髓得以充养，通过服用天王补心汤，心阴心血得到补充，神有所养，人的正常心理、意识和思维活动得以正常进行，二者均使得VD小鼠的认知障碍得以缓解，学习记忆能力得到提高。

SOD是人体主要的抗氧化酶之一，它能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断自由基的毒性反应〔8〕，清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，间接反映了机体自由基产生的量和体内脂质过氧化反应的程度，MDA的量常作为反映机体内脂质过氧化的程度的指标〔9〕。通过对SOD、MDA含量的测定，发现六味地黄汤和天王补心汤能够明显提高SOD活性，降低MDA的含量，对脑细胞起到保护作用，可见六味地黄汤和天王补心汤具有较强的抗氧化能力，其作用机制可能是影响自由基的生成或清除，从而起到脑保护作用。通过光镜观察六味地黄汤和天王补心汤对VD小鼠的病理形态学影响，发现大部分神经细胞形态恢复较好，排列较为整齐，尼氏体形态大致正常，说明六味地黄汤和天王补心汤对VD小鼠的脑神经元有显著保护作用，其中天王补心汤对VD小鼠的治疗作用优于六味地黄汤。

4 参考文献

1张婧婧,闫福岭.步长脑心通防治血管性痴呆的临床研究进展〔J〕.现代医学,2010；38(3)：320-3.

2李东腾,叶明远,孙晓明，等.天王补心丹对记忆能力影响的实验研究〔J〕.中成药，2001；23(4)：296.

3冯 炯,臧 敏.六味地黄丸对痴呆模型小鼠学习记忆及细胞因子的影响〔J〕.山东中医杂志,2010；29(4):264-5.

4Himori N，Watanabe H， Akaike N,etal.Cerebral ischemia model with conscious mice：involvement of NMDA receptor activation and derange-ment of learning and memory ability〔J〕.J Pharmacol Meth，1990；23(4):11-27.

5Fu AL，Huang SJ，Sun MJ.Complementary remedy of aged-related learning and memory deficits via exogenous choline acetyl transferase〔J〕.Biochem Biophys Res Comm,2005；336(1):268-73.

6钱亦华,胡海涛,杨 杰，等.鼠脑铝含量分析及其学习记忆改变的研究〔J〕.微量元素与健康研究,1997；14(3):1.

7李淑娟,张 力,张丹参，等.大黄酚抗衰老作用的实验研究〔J〕.中国老年学杂志,2005；25(11):1362-4.

8张敬伟.NO,SOD与缺血性脑血管病的关系〔J〕.中国误诊学杂志,2005；5(5):900.

9薛 茜,邹玉安,韩 敏，等.康脑液对脑缺血再灌注损伤大鼠血清及脑组织匀浆SOD、MDA、NO的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2010；8(6):709-10.