单克隆抗体制备的筛选过程及意义

摘要：随着单克隆抗体技术应用的愈加广泛，其生产技术也日臻完善。本文就单克隆抗体制备的筛选过程及意义进行了阐述。

关键词：单克隆；抗体；筛选

中图分类号：R392 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-17-20-1

1975年英国剑桥皇家医学委员会分子生物学实验室的Kohler和Milstein成功的用细胞杂交方法把能够产生针对特定抗原的抗体分泌细胞分离出来，在体外长期传代并分泌特异性抗体，这些细胞经过克隆化，可以形成单克隆细胞，能产生针对某一特定抗原决定簇的完全相同的纯净抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。

在单克隆抗体制备过程中，一般需要经历三次筛选过程。

1 HAT选择杂交瘤

细胞融合的选择培养液中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），取三者的字头成为HAT培养液。细胞DNA合成一般有两条途径：主途径是由氨基酸和糖合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程；另一替代途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞正常合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养液选出的HGPRT-细胞株，所以不能在HAT培养液中存活。因为融合细胞具有亲代双方的遗传性能，所以可在HAT培养液中长期存活与繁殖，从而达到细胞分离和纯化的目的。

在单克隆抗体制备过程中，由于细胞融合是一个随机的物理过程，小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞可能有多种形式，不一定就是需要的杂交瘤细胞，如融合的脾细胞和杂交瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养液中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合的瘤细胞则需要进行进一步特别的筛选取出。

2 抗体的检测与筛选

筛选杂交瘤细胞通过选择培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体，因此需要检测特异性抗体，并筛选出所需要的杂交瘤细胞系。根据抗原的性质、抗体的类型不同，需选择不同的筛选方法。常见的为酶联免疫吸附法（ELISA），根据反应结果即可挑选出所需的阳性杂交瘤细胞系。

3 有限稀释法筛选

在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选出的杂交细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群进行再次筛选，选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。因此采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测每个孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附法），上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是单个细胞的，继续进行有限稀释，一般重复3～4次，直至确定每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞为止。

本次筛选也是鉴定的过程。一般杂交瘤细胞需经过2～3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率，这个方法法也同样适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择、识别和分离。

4 意义

通过HAT培养液的筛选作用，正常的脾细胞在培养液中存活仅5～7天，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合的瘤细胞则需要进行特别的筛选取出，从而达到筛选出融合的杂交瘤细胞的目的。但此时融合的杂交瘤细胞仅有少数能分泌针对特定免疫原的特异性抗体，因此需进行第二次筛选，即抗体的检测与筛选。但这次筛选出的抗体能力存在差异，仍需进一步筛选，即第三次筛选，选出活力好、抗性强的细胞。

经过三次筛选过程，最终可选出产生特定抗体的稳定的杂交瘤细胞，并保证细胞板的每个孔中增殖的细胞均为单克隆细胞，从而分泌出单一高效的单克隆抗体。

参考文献

[1] Kohler G，Nature C Continuous cultures of fused cells

secreting antibody of predefined specificiyt[J]. Nature，1975.256（4）：495-497.

[2]许保疆等.单克隆抗体在农业和医学上的应用[J]. 中国畜牧兽医， 2010.37，（7）：86-88.

[3]周东坡，生物制品学[M]. 北京：化学工业出版社， 2007.

作者简介：赵慧娟，硕士学历，长春医学高等专科学校药学系，讲师，研究方向：生物工程。