眼针与体针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织T N F-α表达的差异研究

井欢，于丹，高原，王哲，王莹，潘茜，关洪全

（1．辽宁中医药大学 基础医学院 病理学教研室，辽宁 沈阳 110847；2．辽宁中医药大学 基础医学院免疫与病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110847）

眼针与体针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织T N F-α表达的差异研究

井欢1，于丹1，高原1，王哲1，王莹1，潘茜1，关洪全2△

（1．辽宁中医药大学 基础医学院 病理学教研室，辽宁 沈阳 110847；2．辽宁中医药大学 基础医学院免疫与病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110847）

目的分别观察眼针与体针疗法对缺血再灌注损伤24 h后大鼠脑组织中TNF-α表达的影响，探讨眼针与体针不同疗法对免疫效应表达的差异，为眼针疗法的临床应用提供实验依据。方法线栓法制备SD大鼠大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。将48只 SD大鼠随机分为正常对照组、体针组、模型组、假手术组、眼针穴区组与眼针穴区外组(n=8)。模型组、眼针穴区组、眼针穴区外组与体针组均采用改良的线栓法制备SD大鼠大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。采用ZeaLonga评分法进行大鼠神经功能评分；ELISA方法检测缺血再灌注24 h后大鼠血清TNF-α含量；实时定量PCR方法检测缺血再灌注24 h后大鼠脑皮质TNF-αmRNA的表达；Western Blot法检测缺血再灌注24 h后大鼠脑皮质TNF-α蛋白的表达。结果脑缺血再灌注24 h后，眼针穴区组和体针组大鼠神经功能缺损评分均较模型组大鼠评分降低（P＜0.01），但两者相比无统计学差异，眼针穴区外组大鼠评分与模型组相比较无统计学差异；眼针穴区组、体针组和和眼针穴区外组大鼠血清TNF-α含量均较模型组显著减少（P＜0.01），但以眼针穴区组与体针组减少更明显，眼针穴区组与体针组比较无统计学差异；眼针穴区组、体针组和眼针穴区外组大鼠脑组织TNF-αmRNA含量和蛋白质含量均较模型组显著下调（P＜0.01），眼针穴区组与体针组比较无统计学差异。结论眼针与体针在改善急性脑缺血再灌注损伤中的免疫效应相当，且两种疗法的作用机制可能均与脑组织TNF-α的表达下调有关。

急性脑缺血再灌注损伤；肿瘤坏死因子；眼针疗法；体针疗法

缺血性脑血管病约占全部脑血管病的70%～80%，脑血管疾病已经成为严重危害人类生命和健康的一类疾病。近年来提出了治疗急性脑缺血的一种新方法——神经保护，该法是以脑缺血级联反应的过程作为干预治疗的靶点。脑缺血再灌注后，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是最早出现并发挥作用的细胞因子，是炎症反应的始动因素之一，在缺血再灌注后的脑组织损伤中发挥重要作用。眼针疗法是在眼眶周围用针刺等刺激防治疾病的一种微针疗法，对于急性缺血性脑血管病等多种疾病疗效显著[1-2]。而目前临床体针曲池、足三里两穴对于急性脑缺血疗效显著，有实验显示能有效的减少脑梗死的面积并对梗死边缘区神经细胞呈现一定的保护作用[3]。本研究是通过急性脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）模型，观察针刺眼针穴区、眼针穴区外与体针对CIRI大鼠24 h后神经功能缺损评分及血液、脑组织TNF-α表达变化的影响，旨在探讨眼针疗法与体针疗法对急性CIRI模型大鼠效应的差异性，为眼针疗法的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠48只，雌雄不拘，体重（280±20）g。实验动物购自北京维通利华实验动物中心[动物许可号：SCXK（京）2007-0001]。适应性喂养1 w后实施标准颗粒饲料喂养，动物实验室内保持相对湿度45%，22℃。将实验用SD大鼠以每组8只随机分为正常对照组、假手术组、模型组、眼针穴区组、眼针穴区外组与体针组，共计6组。

1.2 模型的制备与模型评分 采用改良的线栓法[4-7]制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤动物模型，模型组、眼针穴区组、眼针穴区外组与体针组均需复制。模型成功采用标准为：脑组织缺血2 h后进行再灌注，同时参照ZeaLonga评分标准[8]进行神经功能缺损评分，评分为5分制：无症状记0分；不能完全伸展对侧前爪记1分；向对侧转圈记为2分；向对侧倾倒记为3分；不能自发行走，意识丧失记为4分。

实验对象纳入标准：评分1～3分的动物。

假手术组术式同模型组，操作标准为钓鱼线插入深度控制为0.5～1 cm，其他手术术式同模型组。正常组不处理。

1.3 眼针取穴及刺法 眼针穴区组取穴：取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺，用31号13 mm毫针，参照人体取穴方法定位[9-11]（见图1 A）。采用眶上横刺法，于大鼠眶缘处，按照穴区定位线1→8的顺序（见图1 B），从该穴区定位线一端进针，横刺进针3 mm，到另一定位线，留针20 min，10 min时刮针1次，刮针5下。 治疗时间：于脑缺血再灌注后立即进行眼针治疗，之后每12 h针刺1次，取材前30 min进行最后一次眼针治疗。

眼针穴区外组取穴：选择同名穴区的外3 mm处为眼针针刺部位，刺法与眼针穴区相同。

1.4 体针取穴及刺法 体针取穴：以动物比较学方法定位，参照人体相关穴位，按照《中国兽医针灸学》的方法取穴。取穴位：曲池穴（肘关节前外侧凹陷中，直刺5 mm）、足三里穴（膝关节后外侧、腓骨小头下约直刺5 mm处，针法为斜刺1 cm）。

图1 眼针定位示意图（左眼）Fig.1 The locations of acupoint of eye acupuncture (left eye)

1.5 试剂及实验用药 亲和纯化TNF-α多克隆抗体(兔抗鼠)购自武汉博士德生物工程有限公司。TNF-α及β-actin引物由北京华大基因公司制备合成。实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。

1.6 ELISA方法 针刺治疗结束后，麻醉状态下腹主动脉取5 mL，离心分离血清，-70℃保存备用；参照试剂盒产品说明书进行TNF-α检测。利用全自动酶标仪，测定各孔的OD值（450 nm处），采用Curve Expert 1.3绘制标准曲线，通过标准曲线计算浓度值。

1.7 Western blot法 取实验动物缺血再灌注24 h后的脑组织。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，断头后取脑组织，加入裂解液（脑组织∶裂解液=1∶10），制作脑组织样品匀浆，离心15 min（12000 g），取上清即为总蛋白。等量的细胞蛋白提取物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）电泳分离，并转移到PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上。在室温下，PVDF膜在封闭缓冲液中封闭2 h，孵育一抗缓冲液（TNF-α 1∶500），4℃过夜。次日，室温下孵育HRP-标记的二抗缓冲液（1∶3000）2 h。O-dianidine，β-萘酯磷酸钠显色；扫描仪扫描NC(nitrocellulose filter membrane)膜，分析结果。

1.8 实时定量RT-PCR方法 采用Trizol试剂提取脑组织总RNA，应用Quant Reverse Transcriptase逆转录合成cDNA第一链。以适量cDNA为模板，以β肌动蛋白（β-actin）为内参照，PCR扩增TNF-α基因片段，TNF-α上游引物：5′CCACGCTCTTCTGTCTACTG 3′；TNF-α下游引物：5′GCTACGGGCTTGTCACTC 3′。β-actin引物分别为：5′CGTGCGTGACATTAAAGAG 3′，5′TTGCCGATAGTGATGACCT 3′。检测ABI Prism 7500 HT系统中所有产物的序列。以β-actin为内参，以扩增倍数为比较依据，读CT值，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT实验-△CT对照，扩增倍数= 2-△△CT。

1.9 统计学方法 数据采用SPSS 11.5软件统计分析，正态计量数据采用“x±s”表示，使用单因素方差分析法进行组间比较。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分结果 正常组与假手术组均无神经功能障碍表现；模型组表现出行走向对侧旋转、倾倒或提尾时左侧前肢不能伸直等不同程度的神经功能障碍表现。表明脑缺血再灌注损伤大鼠模型复制成功。与模型组比较，眼针穴区组和体针组大鼠神经功能缺损症状减轻（P＜0.01），但两组之间比较差异无统计学意义；眼针穴区外组评分接近模型组，与眼针穴区组、体针组差异显著（P＜0.01，见表1）。

表1 缺血再灌注损伤24 h后各组大鼠脑神经缺损评分Tab. 1 Comparison of the scores of neurologic impairments 24 h after cerebral ischemia reperfusion injury in rats of different groups

2.2 脑缺血再灌注损伤24 h后各组大鼠血清TNF-α含量的变化 ELISA方法检测大鼠血清TNF-α含量，模型组大鼠血清中TNF-α含量明显高于正常组和假手术组（P＜0.01），而穴区组、体针组和穴区外组TNF-α含量均较模型组明显下降，但以穴区组、体针组下降更明显（P＜0.01，见表2）。

表2 脑缺血再灌注损伤24 h后各组大鼠血清TNF-α含量的变化（pg/mL）Tab. 2 Expression of TNF-α in the serum in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion(pg/mL)

2.3 脑缺血再灌注损伤24 h后各组大鼠脑组织TNF-α蛋白的表达 采用蛋白质印记方法检测大鼠脑组织TNF-α蛋白，以β-actin为内参，模型组大鼠脑组织TNF-α蛋白表达明显高于正常组和假手术组（P＜0.01）。与模型组比较，眼针穴区组、体针组和眼针穴区外组大鼠脑组织TNF-α蛋白表达均下调（P＜0.01），但眼针穴区组和体针组与眼针穴区外组相比下调更加显著（P＜0.01），而眼针穴区组和体针组之间比较差异无统计学意义（见表3）。

表3 脑缺血再灌注损伤24 h后各组大鼠脑组织TNF-α蛋白的表达Table 2 Expression of TNF-α protein in the brain tissue in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion

2.4 各组大鼠缺血再灌注损伤24 h后脑组织TNF-α mRNA的表达 脑组织TNF-αmRNA表达的结果见表4，本实验选用β-actin作为内参，β-actin基因扩增产物为132 bp，TNF-α基因扩增产物大小为145 bp。

表4 脑缺血再灌注24 h后各组大鼠脑组织TNF-α mRNA的表达Table 4 Expression of TNF-α mRNA levels in the brain tissue in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion

大鼠脑组织中TNF-αmRNA的表达结果，模型组较正常组和假手术组显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，眼针穴区组和体针组大鼠脑组织TNF-α mRNA表达均显著降低（P＜0.01），但眼针穴区组与体针组之间比较差异无统计学意义。而眼针穴区外组大鼠脑组织TNF-α蛋白表达也较模型组显著降低（P＜0.01，见图2)，但其TNF-αmRNA表达仍显著高于眼针穴区组和体针组（P＜0.01）。

图2 各组大鼠脑缺血再灌注损伤24 h后脑组织TNF-α蛋白的表达1.正常组；2.假手术组；3.模型组；4.眼针穴区组；5.体针组；6.眼针穴区外组Fig. 2 Comparison of the expression of TNF-α protein in the brain tissue in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion1.control group；2.sham operation group；3.model group；4.eye-acupuncture in point area group； 5.eye-acupuncture outside point area group； 6. body acupuncture group

3 讨论

脑缺血再灌注后引起的脑组织损伤是急性脑缺血致死的主要原因之一，因而早期进行神经保护性治疗大大改善了临床缺血性脑血管病的不良预后。

TNF-α是一种参与机体免疫应答和炎症反应的多肽细胞因子，其具有多种生物活性。脑缺血后，脑组织TNF-α表达增加。TNF-α可由循环性巨噬细胞、血管内皮细胞、缺血脑组织的神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞产生。在脑缺血再灌注后的炎症反应中TNF-α可以激活细胞因子在炎症的产生及发展过程中发挥级联放大反应作用。并通过激活NF-κB降解微血管基底膜；还可以趋化炎症细胞，进而促进活化的炎症细胞释放氧自由基，加重血脑屏障受损，诱发脑细胞水肿[5-6]。TNF-α高表达具有加速神经细胞的死亡的神经毒性[7-8]。因此，在脑缺血再灌注急性损伤后，TNF-α的表达受抑可以减轻脑细胞和脑血管的损伤[9-12]。

缺血性脑血管疾病属于中医学中风的范畴。针灸治疗中风疗效显著。眼针疗法是由我院名老中医彭静山先生首先创立。其方法为在眼眶周围针刺用来治疗全身疾病的一种微针疗法，是一种特殊针灸施术针法，经过长期临床实践，结合眼与脏腑、经络的关系疗效显著。中医理论中眼与脑通过经络密切相关。《证治准绳》记载“目形类丸，内有大络六，谓心、肺、脾、肝、肾，命门各主其一；中络八，谓胆、胃，大小肠，三焦、膀胱各主其一；外有旁支细络莫知其数，皆悬贯于脑。”[13-15]《灵枢·大惑论》曰：“五脏六腑之精气，皆上注于目，而为之晴。精之窠为眼，其窠气之精为白眼，肌肉之精为约束。裹撷筋骨血气之精，而与脉并为系，上属于脑，后出于项中，故邪入于项，因逢其身之虚，其入深，则随目系以入脑。”说明眼与脑生理上相互协调，也是病邪传变的途径。

中医学肝肾阴虚为中风病的基本病机之一，气血运行不畅，淤血滞于脑部络脉，引起肢体偏瘫。偏瘫的上肢和下肢分别归属上焦和下焦不同区域。取眼穴肝区、肾区针刺可以滋补肝肾；针刺上焦区、下焦区可以活血通络。本研究结果显示：眼针穴区组和体针组大鼠在CIRI 24 h后的神经缺损评分均较模型组明显降低，表明眼针和体针均可改善CIRI动物的一般状态。而眼针穴区外组大鼠的神经缺损评分与模型组接近，表明针刺眼针穴区外无法改善CIRI动物的神经损伤，只有针刺眼针穴区才可发挥治疗作用。TNF-α的检测结果表明：眼针穴区组和体针组大鼠伴随着神经缺损评分的下降，大鼠血液和脑组织的TNF-α表达也明显地同步下调，表明眼针和体针均通过降低TNF-α表达以减轻对脑组织的损伤作用，两种针刺疗法可能通过相同的途径治疗CIRI。与神经缺损评分的结果一致，针刺眼针穴区外的大鼠血液和脑组织的TNF-α的含量并有所下调，但针刺眼针非穴区对TNF-α表达影响远远小于针刺眼针穴区和体针。本实验结果提示，眼针与体针的疗效相近，但眼针疗法因其取穴少，安全方便，易于掌握而具有更大的临床应用空间。

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The study of differences between eye acupuncture therapy and body acupuncture therapy on tumor necrosis factor-α expression in rats with acute cerebral ischemia reperfusion

JING Huan1, YU Dan1, GAO Yuan1, WANG Zhe1, WANG Ying1, PAN Qian1, GUAN Hong-quan2△
(1. Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang, 110847, China; 2. Department of Immunology and Pathogenic Biology, College of Basic Medical Sciences of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning province, Shenyang 110847, China)

ObjectiveTo observe the effects of eye acupuncture and body acupuncture on tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression in the cerebral cortex of rats after ischemia-reperfusion injury,in order to investigate the differences in therapeutic function between eye acupuncture and body acupuncture against acute cerebral ischemia-reperfusion injury。Method48 Rats established by suture method were randomly divided into control group,sham operation group,model group,eye-acupuncture in point area group,eye-acupuncture outside point area group and body acupuncture group. After reperfusion 24 h,the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks; the levels of plasma TNF-α were determined by ELISA method; the expression of ischemic cerebral cortex TNF-α mRNA was measured by RT-PCR method; the expression of ischemic cerebral cortex TNF-α protein was detected by western blot。ResultsAfter reperfusion 24 h,compared with control group,neurologic impairment marks of eye-acupuncture therapy in point area group and body acupuncture group both decreased obviously (P＜0.01),however there were no signi fi cant differences between the eye-acupuncture in point area group and body acupuncture group ; the levels of plasma TNF-α in rat cerebral cortex after the eye acupuncture therapy and body acupuncture therapy were obviously decreased (P＜0.01),however there were no signi fi cant differences between the eye-acupuncture in point area group and body acupuncture group; the expressions of TNF-α mRNA and protein in rat cerebral cortex after the eye acupuncture therapy and body acupuncture therapy were also obviously down-regulated (P＜0.01),however there were no signi fi cant differences between the eye-acupuncture in point area group and body acupuncture group.Conclusion The eye and body acupuncture therapy show the same effects on treating cerebral ischemia reperfusion. The mechanisms of these two therapies may be related to up regulatingTNF-α expression in rat cerebral cortex with ischemia-reperfusion injury.

acute ischemia-reperfusion injury; tumor necrosis factor-α; eye acupuncture therapy;body acupuncture therapy

R 245.329

A

1005-1678(2014)01-0022-04

国家重点基础研究发展计划项目(2007 CB 512702)；辽宁省博士启动基金项目(20131073)

井欢，女，博士，副教授，研究方向：中药免疫调节机制研究，E-mail：huanj 99@163.com；关洪全，通信作者，男，教授，博士生导师，研究方向：中医药对免疫的调控，E-mail：hongquanguan@sina.com。