款冬组织培养快速繁殖试验研究

王贵军+弓强

摘 要：为满足栽培对种苗的需要，以款冬叶片为材料，进行了愈伤组织诱导与分化，不定芽生根，试管苗的生根继代、移栽和定植的研究。结果表明：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L是叶片愈伤组织诱导培养的最佳培养基；MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L是愈伤组织分化培养的理想培养基；1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.05%是不定芽根培养的理想培养基。

关键词：款冬；组织培养；培养基

中图分类号S567.2 文献标识码A 文章编号1007-7731（2014）14-27-02

款冬别名蜂斗菜、水斗菜，系菊科多年生草本药用植物，以其未开放的头状花序入药，性温，味甘，辛，微苦，有润肺、化痰、止咳等功效。款冬市场行情一直处于稳定上升趋势，市场销量好，价格高，有很好的经济效益和社会效益。但是，由于目前款冬遗传育种基础研究的缺乏和品种退化的问题，其种苗供应难以满足当前市场的需求。为此，笔者对款冬组织培养及快速繁殖进行了研究，以期缩短新品种育成年限、提高育种效率，提供足够的健康种苗。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其处理方法 把生长旺盛、无病害的幼嫩款冬叶片采回实验室，洗衣粉水中浸泡5min，自来水冲洗数次，除去残余。在超净工作台上，用70%的酒精灭菌30s，无菌水冲洗1～2次，然后用0.1%的HgCl2灭菌5～6min，无菌水冲洗5～6次，并用滤纸吸干材料表面水分，灭菌后的材料切成0.5cm×0.5cm的小块，分别接入不同的培养基上，置于培养箱培养。以MS、1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA、NAA、IAA。固体培养基力强度为200g/cm2。以MS为基本培养基加蔗糖30g/L，1/2MS为基本培养基加蔗糖15g/L。光照强度2 500～3 000lx；光照时间12h/d；培养基pH为5.8～6.0；培养温度（25±2）℃。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织诱导培养 在超净工作台上，将无菌叶片切割成0.5cm×0.5cm的小块，迅速接种到以MS为基本培养基，附加不同浓度（6-BA，NAA）的培养基上，进行嫩茎愈伤组织的诱导培养。每种培养基接种50个小块叶片，重复2次，培养25～30d（表1）。

表1 愈伤组织诱导培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种块数&1&0.1&0.1&50&2&0.3&0.1&50&3&0.5&0.1&50&4&1.0&0.1&50&5&1.0&0.2&50&]

1.2.2 芽的诱导分化培养 将已经产生愈伤组织的良好外植体，以MS为基本培养基附加不同浓度的激素组合进行试验（6-BA，NAA）直接继代到新的培养基上，增殖培养15～20d（表2）。

表2 芽的诱导分化培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种数&1&1.0&0.1&50&2&2.0&0.2&50&3&3.0&0.2&50&4&3.0&0.3&50&5&4.0&0.3&50&]

1.2.3 无根苗的增殖培养 取具有展开小叶的丛生芽，接种在原分化培养基上进行增殖培养，可在短期时间内达到快速繁殖的目的（表3）。

表3 芽的增殖培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种数&1&1.0&0.1&50&2&2.0&0.2&50&3&3.0&0.2&50&4&3.0&0.3&50&5&4.0&0.3&50&]

1.2.4 试管苗的生根培养 将生长良好的无根试管苗接种于生根培养基（1/2MS为基本培养基）上进行生根培养，每个处理接种20块（表4）。

表4 试管苗的生根培养

[培养基编号&NAA（mg/L）&接种数&1&0.1&20&2&0.5&20&3&1.0&20&]

（下转32页）

（上接27页）

1.2.5 炼苗移栽 待款冬苗长到约5～7cm，根长约5～6cm，具有5～7片完整叶片时，进行炼苗。3～4d后，将其从广口瓶中取出洗净培养基，移栽于经过杀虫灭菌的温室中，在以下条件下进行培养：温度（25±2）℃；光照强度为2 000lx；光照12h/d。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导与繁殖 将叶片接种于培养基上，培养10～15d后，切口处明显膨大，出现不同程度的增厚，30d后形成颗粒状质地、疏松的黄绿色愈伤组织。由上述试验得出，最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

2.2 芽诱导分化 一般情况下，在植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的配比对植物有明显的影响，当生长素与细胞分裂素比例较大时利于生根，较小时利于芽的分化。由上述试验可得，最佳诱导芽分化的培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。

2.3 试管苗生根 由根的诱导结果看，在一定范围内，随着NAA浓度增加，生根率不断增高，当NAA浓度为0.5mg/L时，诱导苗生根效果最好，生根量多而粗，但随着NAA浓度继续升高，则会使根部愈伤化，抑制生根。

2.4 移栽炼苗 由于离体培养下的再生培养长期在营养丰富的无菌条件下生长，根系活动能力较低，直接接种于土壤中成活率极低，故先进行适应性培养。先将培养瓶的口打开，置于通风处进行大约7d的温度、湿度适应，经过适应性培养的苗可移入土壤中盆栽。将其小心的从培养瓶中取出，洗净基部的培养基，而后置于土壤中栽植，刚开始在室内培养，并细心管理，15d左右可以拿出室外，成活率可达到90%以上。

3 结论与讨论

款冬作为北方的一种重要的药用植物，在组织培养研究方面几乎为空白，故此研究可作为基础实验，进行初步的探索。本次研究在前人的基础上，减小了激素浓度比，将6-BA的浓度设了很小的梯度差别，最大为1.0mg/L，发现小浓度的激素比可以诱导愈伤组织更好地生长。本次研究的结论是：愈伤组织的最佳培养基是MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；芽诱导培养基是MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L；根产生培养基是1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.05%。

随着快速繁殖技术的大规模生产应用，款冬组织培养技术一定会逐渐成熟，从而大大提高款冬的药用质量，扩大生产产量，更加充实中国的药材市场。另外，随着组培技术的不断提高和完善，组培技术的应用范围不断扩大，相信与款冬相关的快繁技术、脱毒技术、培育新品种技术、人工种子技术等应用，将大大改善款冬生产的现状。

参考文献

[1]张智慧，张金渝，金航.组织培养在药用植物育种上的应用[J].西南农业学报，2006，19（增刊）：496-499.

[2]韩碧文，李颖章.植物组织培养中器官建成的生理生化基础[J].植物学通报，1993，10（2）：1-6.

[3]刘用生，李友勇，等.植物组织培养中活性炭的使用[J[.植物生理学通讯，1994，30（3）:214-217.

[4]何士剑，鲁海平.款冬栽培技术[J].甘肃农业科技，2003，11：53.

[5]王小菁.植物生长调节剂在植物组织培养中的应用[M].北京：化学工业出版社，2002：75. （责编：张宏民）

摘 要：为满足栽培对种苗的需要，以款冬叶片为材料，进行了愈伤组织诱导与分化，不定芽生根，试管苗的生根继代、移栽和定植的研究。结果表明：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L是叶片愈伤组织诱导培养的最佳培养基；MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L是愈伤组织分化培养的理想培养基；1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.05%是不定芽根培养的理想培养基。

关键词：款冬；组织培养；培养基

中图分类号S567.2 文献标识码A 文章编号1007-7731（2014）14-27-02

款冬别名蜂斗菜、水斗菜，系菊科多年生草本药用植物，以其未开放的头状花序入药，性温，味甘，辛，微苦，有润肺、化痰、止咳等功效。款冬市场行情一直处于稳定上升趋势，市场销量好，价格高，有很好的经济效益和社会效益。但是，由于目前款冬遗传育种基础研究的缺乏和品种退化的问题，其种苗供应难以满足当前市场的需求。为此，笔者对款冬组织培养及快速繁殖进行了研究，以期缩短新品种育成年限、提高育种效率，提供足够的健康种苗。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其处理方法 把生长旺盛、无病害的幼嫩款冬叶片采回实验室，洗衣粉水中浸泡5min，自来水冲洗数次，除去残余。在超净工作台上，用70%的酒精灭菌30s，无菌水冲洗1～2次，然后用0.1%的HgCl2灭菌5～6min，无菌水冲洗5～6次，并用滤纸吸干材料表面水分，灭菌后的材料切成0.5cm×0.5cm的小块，分别接入不同的培养基上，置于培养箱培养。以MS、1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA、NAA、IAA。固体培养基力强度为200g/cm2。以MS为基本培养基加蔗糖30g/L，1/2MS为基本培养基加蔗糖15g/L。光照强度2 500～3 000lx；光照时间12h/d；培养基pH为5.8～6.0；培养温度（25±2）℃。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织诱导培养 在超净工作台上，将无菌叶片切割成0.5cm×0.5cm的小块，迅速接种到以MS为基本培养基，附加不同浓度（6-BA，NAA）的培养基上，进行嫩茎愈伤组织的诱导培养。每种培养基接种50个小块叶片，重复2次，培养25～30d（表1）。

表1 愈伤组织诱导培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种块数&1&0.1&0.1&50&2&0.3&0.1&50&3&0.5&0.1&50&4&1.0&0.1&50&5&1.0&0.2&50&]

1.2.2 芽的诱导分化培养 将已经产生愈伤组织的良好外植体，以MS为基本培养基附加不同浓度的激素组合进行试验（6-BA，NAA）直接继代到新的培养基上，增殖培养15～20d（表2）。

表2 芽的诱导分化培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种数&1&1.0&0.1&50&2&2.0&0.2&50&3&3.0&0.2&50&4&3.0&0.3&50&5&4.0&0.3&50&]

1.2.3 无根苗的增殖培养 取具有展开小叶的丛生芽，接种在原分化培养基上进行增殖培养，可在短期时间内达到快速繁殖的目的（表3）。

表3 芽的增殖培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种数&1&1.0&0.1&50&2&2.0&0.2&50&3&3.0&0.2&50&4&3.0&0.3&50&5&4.0&0.3&50&]

1.2.4 试管苗的生根培养 将生长良好的无根试管苗接种于生根培养基（1/2MS为基本培养基）上进行生根培养，每个处理接种20块（表4）。

表4 试管苗的生根培养

[培养基编号&NAA（mg/L）&接种数&1&0.1&20&2&0.5&20&3&1.0&20&]

（下转32页）

（上接27页）

1.2.5 炼苗移栽 待款冬苗长到约5～7cm，根长约5～6cm，具有5～7片完整叶片时，进行炼苗。3～4d后，将其从广口瓶中取出洗净培养基，移栽于经过杀虫灭菌的温室中，在以下条件下进行培养：温度（25±2）℃；光照强度为2 000lx；光照12h/d。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导与繁殖 将叶片接种于培养基上，培养10～15d后，切口处明显膨大，出现不同程度的增厚，30d后形成颗粒状质地、疏松的黄绿色愈伤组织。由上述试验得出，最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

2.2 芽诱导分化 一般情况下，在植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的配比对植物有明显的影响，当生长素与细胞分裂素比例较大时利于生根，较小时利于芽的分化。由上述试验可得，最佳诱导芽分化的培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。

2.3 试管苗生根 由根的诱导结果看，在一定范围内，随着NAA浓度增加，生根率不断增高，当NAA浓度为0.5mg/L时，诱导苗生根效果最好，生根量多而粗，但随着NAA浓度继续升高，则会使根部愈伤化，抑制生根。

2.4 移栽炼苗 由于离体培养下的再生培养长期在营养丰富的无菌条件下生长，根系活动能力较低，直接接种于土壤中成活率极低，故先进行适应性培养。先将培养瓶的口打开，置于通风处进行大约7d的温度、湿度适应，经过适应性培养的苗可移入土壤中盆栽。将其小心的从培养瓶中取出，洗净基部的培养基，而后置于土壤中栽植，刚开始在室内培养，并细心管理，15d左右可以拿出室外，成活率可达到90%以上。

3 结论与讨论

款冬作为北方的一种重要的药用植物，在组织培养研究方面几乎为空白，故此研究可作为基础实验，进行初步的探索。本次研究在前人的基础上，减小了激素浓度比，将6-BA的浓度设了很小的梯度差别，最大为1.0mg/L，发现小浓度的激素比可以诱导愈伤组织更好地生长。本次研究的结论是：愈伤组织的最佳培养基是MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；芽诱导培养基是MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L；根产生培养基是1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.05%。

随着快速繁殖技术的大规模生产应用，款冬组织培养技术一定会逐渐成熟，从而大大提高款冬的药用质量，扩大生产产量，更加充实中国的药材市场。另外，随着组培技术的不断提高和完善，组培技术的应用范围不断扩大，相信与款冬相关的快繁技术、脱毒技术、培育新品种技术、人工种子技术等应用，将大大改善款冬生产的现状。

参考文献

[1]张智慧，张金渝，金航.组织培养在药用植物育种上的应用[J].西南农业学报，2006，19（增刊）：496-499.

[2]韩碧文，李颖章.植物组织培养中器官建成的生理生化基础[J].植物学通报，1993，10（2）：1-6.

[3]刘用生，李友勇，等.植物组织培养中活性炭的使用[J[.植物生理学通讯，1994，30（3）:214-217.

[4]何士剑，鲁海平.款冬栽培技术[J].甘肃农业科技，2003，11：53.

[5]王小菁.植物生长调节剂在植物组织培养中的应用[M].北京：化学工业出版社，2002：75. （责编：张宏民）

摘 要：为满足栽培对种苗的需要，以款冬叶片为材料，进行了愈伤组织诱导与分化，不定芽生根，试管苗的生根继代、移栽和定植的研究。结果表明：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L是叶片愈伤组织诱导培养的最佳培养基；MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L是愈伤组织分化培养的理想培养基；1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.05%是不定芽根培养的理想培养基。

关键词：款冬；组织培养；培养基

中图分类号S567.2 文献标识码A 文章编号1007-7731（2014）14-27-02

款冬别名蜂斗菜、水斗菜，系菊科多年生草本药用植物，以其未开放的头状花序入药，性温，味甘，辛，微苦，有润肺、化痰、止咳等功效。款冬市场行情一直处于稳定上升趋势，市场销量好，价格高，有很好的经济效益和社会效益。但是，由于目前款冬遗传育种基础研究的缺乏和品种退化的问题，其种苗供应难以满足当前市场的需求。为此，笔者对款冬组织培养及快速繁殖进行了研究，以期缩短新品种育成年限、提高育种效率，提供足够的健康种苗。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其处理方法 把生长旺盛、无病害的幼嫩款冬叶片采回实验室，洗衣粉水中浸泡5min，自来水冲洗数次，除去残余。在超净工作台上，用70%的酒精灭菌30s，无菌水冲洗1～2次，然后用0.1%的HgCl2灭菌5～6min，无菌水冲洗5～6次，并用滤纸吸干材料表面水分，灭菌后的材料切成0.5cm×0.5cm的小块，分别接入不同的培养基上，置于培养箱培养。以MS、1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA、NAA、IAA。固体培养基力强度为200g/cm2。以MS为基本培养基加蔗糖30g/L，1/2MS为基本培养基加蔗糖15g/L。光照强度2 500～3 000lx；光照时间12h/d；培养基pH为5.8～6.0；培养温度（25±2）℃。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织诱导培养 在超净工作台上，将无菌叶片切割成0.5cm×0.5cm的小块，迅速接种到以MS为基本培养基，附加不同浓度（6-BA，NAA）的培养基上，进行嫩茎愈伤组织的诱导培养。每种培养基接种50个小块叶片，重复2次，培养25～30d（表1）。

表1 愈伤组织诱导培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种块数&1&0.1&0.1&50&2&0.3&0.1&50&3&0.5&0.1&50&4&1.0&0.1&50&5&1.0&0.2&50&]

1.2.2 芽的诱导分化培养 将已经产生愈伤组织的良好外植体，以MS为基本培养基附加不同浓度的激素组合进行试验（6-BA，NAA）直接继代到新的培养基上，增殖培养15～20d（表2）。

表2 芽的诱导分化培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种数&1&1.0&0.1&50&2&2.0&0.2&50&3&3.0&0.2&50&4&3.0&0.3&50&5&4.0&0.3&50&]

1.2.3 无根苗的增殖培养 取具有展开小叶的丛生芽，接种在原分化培养基上进行增殖培养，可在短期时间内达到快速繁殖的目的（表3）。

表3 芽的增殖培养

[培养基编号&6-BA（mg/L）&NAA（mg/L）&接种数&1&1.0&0.1&50&2&2.0&0.2&50&3&3.0&0.2&50&4&3.0&0.3&50&5&4.0&0.3&50&]

1.2.4 试管苗的生根培养 将生长良好的无根试管苗接种于生根培养基（1/2MS为基本培养基）上进行生根培养，每个处理接种20块（表4）。

表4 试管苗的生根培养

[培养基编号&NAA（mg/L）&接种数&1&0.1&20&2&0.5&20&3&1.0&20&]

（下转32页）

（上接27页）

1.2.5 炼苗移栽 待款冬苗长到约5～7cm，根长约5～6cm，具有5～7片完整叶片时，进行炼苗。3～4d后，将其从广口瓶中取出洗净培养基，移栽于经过杀虫灭菌的温室中，在以下条件下进行培养：温度（25±2）℃；光照强度为2 000lx；光照12h/d。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导与繁殖 将叶片接种于培养基上，培养10～15d后，切口处明显膨大，出现不同程度的增厚，30d后形成颗粒状质地、疏松的黄绿色愈伤组织。由上述试验得出，最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

2.2 芽诱导分化 一般情况下，在植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的配比对植物有明显的影响，当生长素与细胞分裂素比例较大时利于生根，较小时利于芽的分化。由上述试验可得，最佳诱导芽分化的培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。

2.3 试管苗生根 由根的诱导结果看，在一定范围内，随着NAA浓度增加，生根率不断增高，当NAA浓度为0.5mg/L时，诱导苗生根效果最好，生根量多而粗，但随着NAA浓度继续升高，则会使根部愈伤化，抑制生根。

2.4 移栽炼苗 由于离体培养下的再生培养长期在营养丰富的无菌条件下生长，根系活动能力较低，直接接种于土壤中成活率极低，故先进行适应性培养。先将培养瓶的口打开，置于通风处进行大约7d的温度、湿度适应，经过适应性培养的苗可移入土壤中盆栽。将其小心的从培养瓶中取出，洗净基部的培养基，而后置于土壤中栽植，刚开始在室内培养，并细心管理，15d左右可以拿出室外，成活率可达到90%以上。

3 结论与讨论

款冬作为北方的一种重要的药用植物，在组织培养研究方面几乎为空白，故此研究可作为基础实验，进行初步的探索。本次研究在前人的基础上，减小了激素浓度比，将6-BA的浓度设了很小的梯度差别，最大为1.0mg/L，发现小浓度的激素比可以诱导愈伤组织更好地生长。本次研究的结论是：愈伤组织的最佳培养基是MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；芽诱导培养基是MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L；根产生培养基是1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭0.05%。

随着快速繁殖技术的大规模生产应用，款冬组织培养技术一定会逐渐成熟，从而大大提高款冬的药用质量，扩大生产产量，更加充实中国的药材市场。另外，随着组培技术的不断提高和完善，组培技术的应用范围不断扩大，相信与款冬相关的快繁技术、脱毒技术、培育新品种技术、人工种子技术等应用，将大大改善款冬生产的现状。

参考文献

[1]张智慧，张金渝，金航.组织培养在药用植物育种上的应用[J].西南农业学报，2006，19（增刊）：496-499.

[2]韩碧文，李颖章.植物组织培养中器官建成的生理生化基础[J].植物学通报，1993，10（2）：1-6.

[3]刘用生，李友勇，等.植物组织培养中活性炭的使用[J[.植物生理学通讯，1994，30（3）:214-217.

[4]何士剑，鲁海平.款冬栽培技术[J].甘肃农业科技，2003，11：53.

[5]王小菁.植物生长调节剂在植物组织培养中的应用[M].北京：化学工业出版社，2002：75. （责编：张宏民）