加热后低温放置对美拉德反应特征颜色和抗氧化性的影响

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(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

加热后低温放置对美拉德反应特征颜色和抗氧化性的影响

张莎莎,景浩*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

为分析短时加热与低温相结合对美拉德反应颜色特征、抗氧化性和反应进程的影响,利用木糖与甘氨酸模式美拉德反应体系,在60℃预加热0、0.5、1h后,置于4℃条件下观测反应变化。通过吸光值和色差的测定、紫外可见吸收光谱的分析、ABTS及DPPH自由基清除率的变化反应体系特征颜色和抗氧化性的变化。结果表明,60℃加热时间越长,木糖-甘氨酸美拉德反应体系的初始吸光值、b值和自由基清除率越大且变化幅度较快,而初始L值和a值则越小。在4℃下放置,反应体系的吸光值均随着反应时间的延长呈现上升趋势；L、a、b值均呈现下降趋势；加热0和0.5h的反应体系在紫外区265nm处出现特征峰,而加热1h的体系无此特征峰出现,不同体系在可见光区均在580nm和630nm处出现特征峰,且随着反应时间的增加吸光强度不断增大；ABTS、DPPH自由基清除率均随着反应时间的延长呈现上升趋势,但ABTS自由基清除率的增加较明显,而DPPH自由基清除能力增加较平缓。

木糖,甘氨酸,美拉德反应,短时加热,低温反应

美拉德反应(Maillard Reaction,MR)又称羰氨反应,主要发生在含有羰基和含有氨基的化合物中,是食品色泽和风味的主要来源[1]。但是食品基质一般较复杂,且发生美拉德反应后所生成的产物也比较复杂,故常用含有羰基的糖和含有氨基的氨基酸建立模式美拉德反应体系来进行研究[2],单一模式的美拉德反应的整个反应进程受糖和氨基酸的种类、糖和氨基酸的比例、pH、加热温度、缓冲液、反应时间、溶剂等因素的影响,已有很多研究证实温度和时间的变化对美拉德反应的影响最重要,随着温度的升高,美拉德反应的速率也将随之增加[3]。美拉德反应生成类黑精一般需要经历三个不同的阶段：初级、中级和终级三个阶段,而中级阶段的还原酮路线,Osulose路线和Strecker路线三个不同的途径产生的中间产物是生成大分子类黑精不可或缺的步骤[4],也是特征色产生的关键步骤。根据Murakami等[5]的报道可知在美拉德反应初期木糖-甘氨酸生成了蓝色物质,木糖-组氨酸生成了黄色物质、木糖-精氨酸生成了红色物质,随着反应的进行,这些蓝色、黄色和红色物质会进一步反应生成棕褐色物质。孙倩等[6]报道了,木糖-甘氨酸美拉德反应体系在60℃下便会在较短时间内由蓝色迅速转变为绿色。尹姿等[7]报道,木糖-甘氨酸美拉德反应体系在30℃下加热48h,便会生成蓝色产物。张莎莎等[8]报道,木糖-甘氨酸美拉德反应体系在4℃下放置15d,在第6d转变为淡蓝色,随着反应时间的延长,反应体系的蓝色逐渐加深,直至15d时变成深蓝色。综合上述报道可知,不同温度下生成特征色所需要的时间和反应进程都有一定的差异。为了控制美拉德反应的进程,研究美拉德反应特征色的生成过程,本研究将60℃加热和4℃低温放置两种温度条件结合,在60℃加热0、0.5、1h后,然后置于4℃条件下避光进行反应,从而来研究复合温度条件对木糖-甘氨酸美拉德反应体系特征性蓝色生成和抗氧化性的影响。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

D-木糖(D-xylose,MW150.13,含量98.5%) 购于北京嘉康源科技发展有限公司；L-甘氨酸(L-glycine,MW75.07,含量大于99%) 购于天津华阳生物科技有限公司；碳酸氢钠(NaHCO3,MW84.01)、乙醇(Ethanol,EtOH,纯度≥95%) 均购于北京化工厂；2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2′2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH) 均购于美国Sigma 公司。

XB 220A电子天平 Precisa Gravimetrics AG；QL-901涡流振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;pHS-3C+酸度计 成都市纪方舟科技有限公司；ADCI系列全自动色差计 北京辰泰克仪器技术有限公司；Model 680酶标仪 美国Bio-Rad公司；UV-1200型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 美拉德反应体系溶液的制备 木糖-甘氨酸美拉德反应体系中各物质的最终摩尔浓度为：木糖1mol/L,甘氨酸0.33mol/L,NaHCO30.05mol/L,加入乙醇的体积占反应体系总体积的20%,用8mol/L的HCl溶液将体系pH调至7.5；将配制好的反应体系分成3等份,分别在60℃条件下预先加热0、0.5、1h后,将预处理后的三个体系置于4℃条件下反应15d,每隔3d取样一次,样品置于-20℃冰箱中待用。

1.2.2 吸光值和颜色的测定 取各样品原溶液300μL到96孔板中,用酶标仪分别在450、570、630nm下测吸光值；用UV-1200型紫外分光光度计对样品液从200～700nm进行紫外可见光谱扫描,为保证读数在合适的范围内,可以将反应物稀释一定倍数。

用ADCI-60-C型全自动色差仪测定样品溶液Lab色差值的变化,其中L表示从0(黑色)至100(白色)范围内样品的亮度；根据色差计的设定,a值表示从-128(绿色)至+127(红色)范围内样品的颜色；b值表示从-128(蓝色)至+127(黄色)范围内样品的颜色。色差仪先预热30min,用标准黑板校准黑色后,盖上标准白板校准白色,测定时取5mL样品原液于玻璃皿中,每个样品测3次,记录L、a、b值。

1.2.3 ABTS自由基清除率测定 参照尹姿等[7]的方法。简述如下,将0.5mL 14mmol/L ABTS和0.5mL 4.9mmol/L过硫酸钾混合,使ABTS和过硫酸钾的终浓度分别为7mmol/L和2.45mmol/L。混合溶液在室温、避光条件下静置过夜,形成ABTS工作液,在使用前用PBS缓冲液稀释(15～30倍),使其在630nm波长下的吸光值为0.50±0.02,形成ABTS工作液。在96孔板中进行ABTS自由基清除实验。在样品孔中加入10μL样品、90μL ABTS自由基溶液(Abs样品),在颜色对照孔中加入10μL样品、90μL PBS缓冲液作为样品颜色对照(Abs对照),在空白对照孔中加入10μL PBS、90μL ABTS工作液(Abs空白)。在黑暗室温环境下放置8min,在630nm波长下读取吸光值(Abs),带入下式计算：

ABTS自由基清除率(%)=[Abs空白-(Abs样品-Abs对照)]/Abs空白×100

1.2.4 DPPH自由基清除率测定 参照李琦[9]测定的方法并稍作修改。简述如下,称取9.8mg DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶于10mL无水乙醇中,配制成浓度为25μmol/L的储备液,使用前用无水乙醇稀释储备液至浓度为1.56μmol/L的工作液。在96孔板中进行DPPH自由基清除实验。在样品孔中加入15μL样品、60μL Tris-HCl 和150μL DPPH工作液(Abs样品),在颜色对照孔中加入15μL样品、60μL Tris-HCl和150μL无水乙醇(Abs对照),在空白对照孔中加入15μL无水乙醇、60μL Tris-HCl和150μL DPPH工作液(Abs空白)。在黑暗室温环境下放置30min,在520nm波长下读取吸光值(Abs),带入下式计算：

DPPH自由基清除率(%)=[Abs空白-(Abs样品-Abs对照)]/Abs空白×100

1.2.5 数据处理方法 数据的显著性差异由Minitab软件进行分析。对均数进行单因素方差分析(One way analysis of variance,One way ANOVA),进一步以Tukey多重比较进行检验,得到各组均数间的显著性差异(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1木糖-甘氨酸美拉德反应体系紫外光谱扫描

由图1可知,在200～400nm的紫外光区,60℃加热0和0.5h的木糖-甘氨酸美拉德反应体系在整个反应过程中均在265nm处出现特征峰,而60℃加热1h的反应体系并无此特征峰出现。60℃加热0h的体系在4℃下放置第3d在265nm处出现明显的特征峰,且随着反应时间的增加,吸光强度逐渐呈现上升趋势；60℃加热0.5h的体系在加热完成时即在265nm处出现了明显的特征峰,随着反应进行至第6d时,特征峰消失；而60℃加热1h的体系从加热结束至4℃放置的整个反应过程中都未在265nm处出现特征峰。根据Jing等[3]的报道可知,在265nm处容易出现α-二羰基化合物,结合色差的变化,60℃加热0.5h的体系,4℃放置反应至第9d和60℃加热1h的体系没有明显的蓝色产生,我们可推知：265nm处的α-二羰基化合物可能是生成蓝色物质的主要前体物质。

图1 Xyl-Gly MR体系的紫外光谱

2.2木糖-甘氨酸美拉德反应体系可见光谱扫描

由图2可知,在400～700nm的可见光区,60℃加热不同时间的木糖-甘氨酸美拉德反应体系均在580nm和630nm处出现特征峰,随着反应时间的延长,吸光强度均增加。60℃加热0h的体系在4℃下放置至第9d时出现明显的特征峰,60℃加热0.5h的体系4℃下仅放置3d便有特征峰出现,而60℃加热1h体系加热完成后便有特征峰出现。60℃加热时间越长,特征峰出现时间越早,且在4℃下放置的0～15d内,随着反应时间的延长,反应体系的吸光强度上升越快。有报道木糖-甘氨酸美拉德反应体系的颜色特征物主要出现在580nm和625nm处[10],我们检测的颜色特征峰出现在580nm和630nm处,主要是由于环境或检测仪器的略微不同所致。根据400～700nm可见光区的光谱扫描结果,同时结合色差和吸光值的变化,可推知：60℃加热能明显促进低温反应的进行。

图2 Xyl-Gly MR体系的可见光谱

2.3木糖-甘氨酸美拉德反应体系吸光值的变化

由图3可知,木糖-甘氨酸美拉德反应体系在60℃加热时间越长,初始吸光值越大。4℃下放置,在0～15d内,随着4℃放置时间的延长,三个体系在450、570、630nm处的吸光值均呈现上升趋势,上升幅度依次为：1h>0.5h>0h。60℃加热时间越长吸光值的变化越快,但当反应体系的吸光值高达2.5以上时,反应体系的颜色过深可能致使在任何波长下都有较高的吸光值,并不能代表特征色的变化。根据Mruia等[11]和Murakami等[5]的综合报道可得出：627nm处有明显的特征峰,经分离鉴定可知此处产生的为蓝色物质。由于仪器的略微差异,630nm为蓝色物质特征峰,同时根据图3中630nm处木糖-甘氨酸美拉德反应体系吸光值的变化发现,60℃加热0.5h体系仅在4℃条件下放置3d的吸光值和60℃加热0h体系在4℃下放置12d的吸光值相差无几,而60℃加热1h后的吸光值已较大。450nm的吸光值常用来判断美拉德反应的褐变程度[12],450nm处吸光值的不断增大可判断整个体系的褐变程度不断的增强。综合450、570和630nm处吸光值的变化可推知,加热能明显促进低温反应的发生和进行。

图3 Xyl-Gly MR体系的吸光值变化

2.4木糖-甘氨酸美拉德反应体系颜色的变化

由表1可知,木糖-甘氨酸美拉德反应体系在60℃加热的1h内,随着加热时间的延长,L、a值均迅速降低，b值呈升高趋势。60℃分别加热0、0.5、1h的体系,在4℃下放置的0～15d内,L、a、b值也均随着反应时间的延长呈现下降趋势,加热时间越长的体系在4℃下放置时色差值下降的越快。根据肉眼观察,60℃加热0h的体系,4℃下放置,反应第6d出现淡蓝色,随着反应时间的延长,蓝色逐渐加深；60℃加热0.5h体系,加热结束后,反应体系呈现淡蓝绿色,4℃下放置,反应进行至第3d便呈现深蓝色,随着反应时间的延长,反应体系的颜色逐渐加深,反应进行至第9d时肉眼观察呈现黑色,可能是由于反应体系颜色较深,才导致用色差仪检测时光线无法返回,致使无数值呈现；60℃加热1h体系,加热完成后,反应体系呈现绿色,4℃下放置,随着反应时间的延长,反应体系的颜色越来越深。总体而言,由L、a、b值变化和下降程度的不同可推知：60℃加热促进了木糖-甘氨酸美拉德反应体系的发生和进行,但加热时间过长可能导致反应体系颜色变化过快,且颜色较深,无法得到所需要的特征蓝色。

表1 Xyl-Gly MR体系的色差变化

注：数值=平均值±标准差,见1.2.5。上标字母a～d的不同表示同一行不同反应时间有显著性差异；而上标字母A～C的不同则表示同一列不同时间有显著性差异(p<0.05)。 -无数值,推测可能是由于反应体系的颜色过深,导致光线无法返回,故无数值呈现。

2.5木糖-甘氨酸美拉德反应体系ABTS/DPPH自由基清除率

由图4可知,60℃加热时间越长,反应体系的起始自由基清除能力越大。结合色差和吸光值的变化,可推知反应体系的颜色越深,ABTS自由基清除能力越强。将反应溶液稀释15倍后,整个反应体系仍具有很高的ABTS自由基清除率,这和张凌燕等[2]的报道结果相一致。60℃加热0、0.5、1h后,4℃下放置15d,三个体系的ABTS自由基清除率呈缓慢上升趋势,具体变化趋势为1h加热组>0.5h加热组>0h未加热组。未加热(0h)和加热(0.5、1h)组的初始DPPH自由基清除率有明显的差异,但随着反应的进行,未加热组DPPH自由基清除率逐渐增加,在15d时与加热组接近同一水平。4℃下放置15d,加热组DPPH自由基清除率无明显的变化。由此可知,同一反应体系ABTS和DPPH自由基清除率差异的出现,可能与两者本身的清除原理不同有必然的联系。

图4 Xyl-Gly MR体系的ABTS/DPPH自由基清除能力变化

3 结论

本实验通过比较木糖-甘氨酸美拉德反应体系在60℃下分别加热0、0.5、1h后的变化,证实60℃加热较短时间可以促进4℃低温反应的进行,但是加热时间过长,由于温度过高,反应速率过快,可能跨越特征色产物的生成过程。整体而言,60℃加热后在4℃下放置,随着反应时间的延长,各个反应体系的颜色逐渐加深,且60℃加热0h的体系较加热0.5和1h的体系颜色鲜亮些,结合各个指标可知：60℃加热0h的体系在反应进行至12d时产生最优的亮蓝色,而60℃加热0.5h体系明显缩短产生蓝色的时间,在反应进行至3d时便产生蓝色,但60℃加热1h的体系却没有明显的蓝色生成。该实验结果同时进一步证实了反应体系的颜色越深ABTS自由基清除率越高,而DPPH自由清除率在颜色较深时变化不大,这可能与两者自由基清除原理不同有关。结合200～400nm紫外光谱扫描结果推知：265nm处物质的存在与否可能与蓝色物质的生成有一定的关系,但仍须进一步研究。在以后的研究中可进一步研究反应初期不同物质的产生和特征色物质产生的相互关系。本文研究结果对于美拉德反应产物的制备具有一定的参考价值。

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Effect of two phases of high and low temperatures on characteristic color development and antioxidant activity in Maillard reaction system

ZHANGSha-sha,JINGHao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Characteristic color development and free radical scavenging activity in Xyl-Gly Maillard reaction system was investigated under two phases of high and low temperatures. The Xyl-Gly Maillard reaction system was heated at 60℃ for 0,0.5,1h and then set at 4℃ for 15d. The results showed that,the longer time heated at 60℃,the greater initial values of absorbance,b and free radical scavenging rates. The absorbance intensity gradually increased,and the color values of L,a,b all decreased during 15d at 4℃. The characteristic peaks at 265,580 and 630nm appeared on the UV-Vis,with increased absorbance intensity at 580 and 630nm and disappearance of the peaks at 265nm. ABTS and DPPH radical scavenging rates increased with increasing time at 4℃. Preheating could promote the Maillard reaction in low temperature,but the characteristic peak at 265nm disappeared as heating temperature increased.

xylose;glycine;Maillard reaction;short time heated;low temperature reaction

2013-06-17 *通讯联系人

张莎莎(1989-)，女，硕士，研究方向：美拉德蓝色反应产物的制备技术。

“十二五”农村领域国家科技计划课题子课题(2011BAD23B02)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0061-05