高压氧对外伤性癫痫动物模型的治疗作用

林开颜 ，李沐 ，谢泽宇 ，杨剑玲 ，周文 ，黄钦国 ，许梓壁 ，王英博

高压氧对外伤性癫痫动物模型的治疗作用

林开颜1*，李沐2*，谢泽宇2，杨剑玲3，周文2，黄钦国2，许梓壁2，王英博2

目的：研究高压氧治疗（HBOT）对外伤性癫痫（PTE）动物模型的治疗作用。方法：42只成年SD大鼠随机分为正常组（12只）、模型组（12只）及HBOT组（18只），通过注射氯化亚铁制作PTE模型，HBOT组予HBOT 3个疗程，观察各组癫痫发作的行为及脑电图表现，RT-PCR检测c-mycmRNA的表达。结果：HBOT组的癫痫发作较模型组明显减少，脑电图上痫样放电潜伏期延长，频率减慢和波幅降低；模型组中c-myc表达较正常组显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，HBOT组中c-myc表达显著减少（P＜0.01）。结论：HBOT对PTE具有积极治疗作用，其机制可能与ARF-MDM 2-p53通路及Bcl-2的表达有关。

外伤性癫痫；高压氧；动物模型；c-myc

外伤性癫痫（post-traumatic epilepsy，PTE）是外伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）引起的一种癫痫形式，在TBI患者中PTE的发病率为1.9%～30%[1]。PTE主要是由于脑外伤后局部脑组织缺氧缺血，导致神经元死亡，从而引起癫痫[2]。

高压氧治疗（hyperbaric oxygen therapy，HBOT）是指在高压氧仓内，吸入一个大气压（101.33 kPa）以上与环境同等压力的纯氧，通过血液循环携带更多的氧到病损的组织和器官，迅速改善和纠正组织缺氧，促进病损组织的修复和功能恢复[3]。HBOT可在脑组织缺氧缺血的情况下，为组织细胞供氧，减少无氧酵解，维持能量代谢，阻断钙超载的过程，避免神经细胞损伤的发生和发展；阻断线粒体呼吸链发生“单价泄漏现象”，并保护线粒体免受自由基攻击，减轻氧自由基对神经细胞和脑微血管细胞的损害[4-7]。因此，本研究拟采用皮质注射氯化亚铁致PTE动物模型进行HBOT治疗，检测HBOT后局部脑组织c-myc的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠42只，体质量180～220 g，采用随机数字表法分为正常组（n=12）、模型组（n=12）和 HBOT 组（n=18）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 正常组不予任何处理；模型组和HBOT组参考文献[8]方法，大鼠以10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉，固定于立体定向架，暴露颅骨，根据注射部位确定钻颅部位，右额叶运动区皮质注射FeCl2（0.1mol/L，10μL）致痫后立即腹腔内注射3mg/kg生理盐水。HBOT组致痫后予以HBOT，每次治疗70min，舱内氧浓度为80%～90%，氧分压为0.170～0.180MPa；每天1次，每7次为1疗程，疗程间间歇3 d，共行21次治疗，历时30 d。

1.2.2 脑电记录及行为学观察 将前端钝圆的纯银丝置于硬脑膜之外，用牙托粉将银丝与颅骨牢固地固定起来，银丝的另一端连接无线蓝牙脑电监测系统。3组在制模后以视频脑电图（video-EEG，VEEG） 进行检测。根据Racine分级，4级以上发作，EEG在尖、棘波基础上出现阵发性异常放电为模型成功。

1.2.3 取材 制模后30 d将3组大鼠以100 g/L水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔麻醉，经左心室-升主动脉插管，室温下灌注生理盐水150m L，再灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L PBS（pH 值 7.4，4℃）300m L，完整取脑，取材（海马及额叶），固定，石蜡包埋。约位于海马CA3层面及额叶以石蜡切片机连续冠状切片用于HE染色。

1.2.4 c-myc半定量PCR 用Trizol法提取总RNA，用逆转录试剂盒进行cDNA合成，进行PCR反应。以总RNA为模板逆转录得到cDNA。引物用Primer prem ier5.0软件设计。c-myc上游引物序列：5'-CAGCTCGCCCAAATCCTGTA-3'，下游引物序列：5'-TGATGGGGATGACCCTGACT-3'。反应条件：预变性94℃1m in，变性 94 ℃ 20 s，退火 62 ℃ 30 s，延伸72℃30 s，最后一次延伸72℃5min，共27个循环。PCR产物鉴定：取PCR产物，在1.5%琼脂糖凝胶上，IOOV电泳20min后观察。图像分析仪进行图像分析，计算待测基因光密度比值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件分析数据，计量结果以（均数±标准差）（x±s）表示，单因素方差分析两两比较LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学表现

FeC12注射致痫后 1～45min，大鼠出现阵发性凝视、不动，后开始表现为湿狗样运动，出现自动症，如重复、刻板地点头、咀嚼、哈欠、喷嚏等，伴面部抽动及轻度边缘性惊厥，出现一侧前肢震颤；站立、双前肢震颤及持续性点头；双前肢震颤加重，失去平衡跌倒而出现全身性强直-阵挛性发作；造模过程无死亡。麻醉清醒后，活动、进食减少，局灶性发作多见，部分可见全身肌肉紧张、弓背。正常组无上述表现，模型组出现典型急性期、静止期及发作期，HBOT组发作频率及持续时间较模型组明显减少。

2.2 脑电图变化

正常组大鼠的EEG频率以5～10 Hz为主，波幅＜200 pV，以低幅p波、Q波为主，散在e波，未见癫痫样放电，见图1A。模型组大鼠注射FeC12后平均经过5 s的潜伏期，EEG表现出多种形式的癫痫样放电波形，典型波形有单棘波、多棘波、多相棘波、棘节律、慢波、棘慢波、尖波、发作性节律波、发作后抑制等，频率最快可达30 Hz，波幅高达310 pV以上，发作后可出现抑制波，部分存在亚临床放电，见图1B。与模型组比较，HBOT组痫样放电潜伏期延长，频率减慢和波幅降低，发作次数明显减少，见图1C。

2.3 组织学观察

模型组及HBOT组的注射部位神经元变性、死亡，细胞结构瓦解、紊乱，见图2。模型组海马神经元缺失，CA3区最明显，细胞核固缩、浓染，出现嗜酸性神经元，细胞排列紊乱，胶质细胞增生，见图3。与模型组比较，HBOT组神经元变性、死亡，细胞结构瓦解、紊乱较轻，见图2C、3C。

2.4 高压氧对c-mycmRNA表达的影响

正常组、模型组、HBOT组中c-myc mRNA 表达分别为（4.32±1.02）、（8.10±2.05）、（4.78±2.12），模型组中 c-myc 表达较正常组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HBOT组中 c-myc表达显著减少（P＜0.01），见图 4。

图1 正常组（A）、模型组（B）、HBOT组（C）大鼠 EEG

3 讨论

本研究制模大鼠的行为学及EEG表现均接近于临床，且死亡率为0，认为制模成功。

目前国内外关于HBOT治疗PTE的研究仍较少，且主要为临床研究，治疗机制的研究仍甚少。临床研究认为HBOT对PTE具有积极治疗作用。苑来生等[9]通过对40例PTE患者进行高压氧综合治疗，并与非高压氧治疗的30例进行疗效比较，结果HBOT组的有效率为87.5%，对照组的有效率为66.7%，2组有效率差异有统计学意义（P＜0.05）。目前国内外尚无HBOT治疗PTE动物模型研究，本研究将填补这方面的空白。本研究结果显示，与模型组比较，HBOT组癫痫发作频率及持续时间明显减少；且HBOT组的EEG较模型组痫样放电潜伏期延长，频率减慢和波幅降低，发作次数明显减少。镜下观察病理切片发现HBOT组神经元变性、死亡的程度较模型组轻。这说明HBOT对PTE动物模型有积极治疗作用。

细胞过度凋亡在PTE发病过程中发挥重要作用[10]。D'Ambrosio等[11]发现PTE大鼠在致伤第8周后出现自发性癫痫，病理切片发现损伤部位及附近区域脑组织神经元丢失严重。本研究再次验证上述结果，同时还发现HBOT可有效抑制神经细胞过度凋亡。

图2 正常组（A）、模型组（B）、HBOT 组（C）大鼠右侧额叶组织学观察（HE染色，×400）

图3 正常组（A）、模型组（B）、HBOT组（C）大鼠右侧海马组织学观察（HE染色，×400）

图4 3组c-mycmRNA的PCR电泳图

本研究发现模型组中c-myc表达较正常组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HBOT组中 c-myc表达显著减少（P＜0.01）。笔者推测HBOT可能通过限制c-myc过度表达，从而抑制神经细胞过度凋亡，最终抑制PTE发作。有研究表明，MYC失调使ARF上调，并通过ARF-MDM 2-p53通路诱发凋亡[12,13]。与此同时，Efichen等和Ma-clean等证实MYC过度表达间接地抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达[14]；抑制凋亡蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）可调节线粒体外膜渗透率，以阻断细胞色素 C（Cytochrome C）、细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）等蛋白的释放，从而抑制染色质浓缩等致细胞凋亡的病理过程[15]。故笔者推测HBO治疗PTE主要机制可能与ARF-MDM 2-p53通路及Bcl-2有关。

综上所述，笔者认为HBOT对PTE具有积极治疗作用，其主要机制可能与ARF-MDM 2-p53通路及Bcl-2有关。本研究的样本数量及观察周期有其局限性，需进一步深入研究。

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Study of Therapeu tic E ffect of Hyperbaric Oxygen on Anim al M odels of Post-traum atic Ep ilepsy

LIN Kai-yan,LIMu,XIE Ze-yu,YANG Jian-ling,ZHOUWen，HUANG Qin-guo,XU Zi-bi,WANG Ying-bo.Department of Pediatrics,Shantou Central Hospital,Affiliated Shantou Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangdong 515031,China

Objective:To investigate the therapeutic effect of Hyperbaric Oxygen therapy (HBOT)on posttraumatic epilepsy(PTE)rats.Methods:Forty-two adultSD ratswere random ly divide into controlgroup(n=12),modelgroup(n=12)and HBOT group(n=18).The traumatic epilepsymodelswere induced by injecting ferrous chloride.Then the HBOT group were treated by HBofor 3 courses.The behavior and electroencephalogram(EEG)of 3 groups were observed after traumatic epilepsy attack induction.And the expression level of c-myc mRNA was exam ined by Real-time PCR.Results:Compared with themodelgroup,the number of post-traumatic seizure attacks in HBOT group wasobviously decreased,and elongation of latentperiod of epileptiform discharge,frequency deceleration,amplitude decreasing were also observed in EEG.Compared with the control group,the expression levelsof c-myc in themodelgroup was significantly increased(P＜0.01).And compared with themodel group,the expression levelof c-myc in the HBOT group was significantly decreased(P＜0.01).Conclusion:HBOT has positive therapeutic effect for PTE,and themechanismsmay connectwith ARF-MDM 2-p53 pathway and expression of Bcl-2.

post-traumatic epilepsy;hyperbaric oxygen;animalmodel;c-myc

R741;R741.05

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.007

1.汕头市中心医院（中山大学附属汕头医院）儿科 广东汕头515031

2.汕头大学医学院第二附属医院神经外科 广东汕头515041

3.汕头大学香港中文大学联合汕头国际眼科中心 广东汕头515041

广东科技项目（No.2011B031800109）；国家级大学生自主创新训练项目（No.1056013092）

2013-12 -27

谢泽宇 shenjingwaike3@ 163.com

*为并列第一作者

（本文编辑：王晶）