尾状山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

薄存瑶等

摘 要： 本研究利用一对α-醇溶蛋白基因的特异引物，从小麦近缘植物尾状山羊草Y46中克隆获得5个α-醇溶蛋白基因，与NCBI已提交的α-醇溶蛋白序列进行多重比对分析发现，本研究获得的α-醇溶蛋白基因与已知的小麦及其近缘植物中的α-醇溶蛋白基因序列具有较高的相似性，其编码的氨基酸序列存在一定的多态性；在潜在的致敏性上，在这5个α-醇溶蛋白序列中未发现任何已知的与乳糜泻病相关的抗原表位，这在小麦及其近缘植物中较为罕见；进化分析表明，来自C染色体组中的α-醇溶蛋白与来自M和U染色体组的α-醇溶蛋白具有较近的亲缘关系。

关键词： 尾状山羊草；α-醇溶蛋白；基因克隆

中图分类号： S512.1+9+Q785 文献标识号：A 文章编号： 1001 - 4942（2014）08 - 0006 - 05

Cloning and Sequence Analysis of α-Gliadin Genes from Aegilops caudata

Bo Cunyao，Du Xuye，Liu Guojuan，Yin Huayan，Wang Hongwei， Li Anfei， Kong Lingrang

（Agronomy College， Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

Abstract Five α-gliadin genes were cloned with a pair of specific primers from Aegilops caudata Y46. Their sequences had higher similarity with those of the published α-gliadin genes of wheat and its kindred plants in NCBI， and their encoded amino acid sequences had polymorphism. None of the published epitopes related with celiac disease were discovered in the five α-gliadins， which was rare in wheat and its kindred plants. The evolution analysis declared that the α-gliadins from C genome had a close relationship with those from M and U genomes.

Key words Aegilops caudata； α-gliadins； Gene clone

麦醇溶蛋白和麦谷蛋白是面筋蛋白的两大主要组分，其含量和组成影响着小麦面团黏弹性和烘焙品质[1]。在小麦面粉中醇溶蛋白占总蛋白的40%～50%，其构成具有高度的复杂性和异质性[2]。依据酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）迁移率的差别，将醇溶蛋白分为α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白四类，分别占总蛋白含量的5%、30%、30%和15%[3]。麦醇溶蛋白是由第1、6同源群染色体短臂上的 Gli-1（Gli-A1、Gli-B1和Gli-D1）和Gli-2（Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2）位点编码 [4]，在这六个位点上存在广泛的变异，目前已在 Gli-1 和Gli-2 位点上鉴定出130个等位变异[5]。

α-醇溶蛋白不但与小麦面粉的加工品质密切相关，也是引发乳糜泻病的主要活力蛋白[6]。乳糜泻病（Celiac Disease，简称CD）是一种对小麦麸质过敏的肠道疾病，又称为面筋蛋白过敏性肠病。发病原理为：易感个体摄入麦类（如小麦、大麦、燕麦和黑麦等）的麸质蛋白后，由于小肠吸收的不耐受性引起慢性小肠吸收不良综合征，严重的甚至会导致肠粘膜受损。目前已发现大量能诱发CD发生的分布于醇溶蛋白的T细胞免疫肽，即“毒性肽”，其中有4种具有较高免疫活性，包括Gli-α9、Gli-α2、Gli-α20和Gli-α，免疫肽段分别为PFPQPQLPY、PQPQLPYPQ、PFRPQQPYPQ和QGSFQPSQQ[7]。

本研究从尾状山羊草Y46中克隆了5个新的α-醇溶蛋白基因，并对其进行了序列分析，为进一步丰富小麦α-醇溶蛋白基因资源及品质改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

尾状山羊草（种质编号Y46）由中国农业科学院作物研究所提供。pMD18-T克隆载体购于大连宝生物公司；pESAY-E2表达载体、Hifi Taq 高保真酶购于北京全式金生物技术有限公司；DH5α菌株、基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购于北京天根公司。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 将尾状山羊草种子在室温下萌发，当叶片长到10 cm左右时，利用植物基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，提取方法参照试剂盒说明书进行。

1.2.2 基因克隆及序列测定 根据GenBank公布的α-醇溶蛋白基因序列设计引物P1：5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG3′、P2：5′-TCAGTTA/GGTACCG/AAAGATGCC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR扩增程序为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 序列分析 DNA序列分析、氨基酸序列翻译、进化树构建等参考杜旭烨等[8]的方法。

2 结果与分析

3 讨论

较多研究表明醇溶蛋白的变异和分子结构与面粉的加工品质密切相关。本研究获得的5个α-醇溶蛋白虽然与已知的α-醇溶蛋白序列具有较高的同源性，但仍存在一些差异，如重复区长度的不同、多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺残基含量的不同以及非谷氨酰胺的出现等。多聚谷氨酰胺Ⅰ区和Ⅱ区是α-醇溶蛋白的典型特征，这两个区几乎全由谷氨酰胺组成。其中，编码谷氨酰胺的密码子有两个：CAG和CAA，它们以不同的串联重复形式出现，形成类似微卫星（SSR）的序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ区CAG和CAA两个密码子几乎各占一半，而在多聚谷氨酰胺Ⅱ区只出现CAA密码子。非谷氨酰胺的残基一般为A、E、L、R和K五种氨基酸中的一个或几个。Li等[9]研究表明长的重复区与面筋的加工品质呈正相关。另外，Xie等[10]研究表明高的谷氨酰胺残基含量会提高面筋的粘弹性，可能是由于谷氨酸盐间的相互作用提高了氢键的含量。Anderson等[11]指出，非谷氨酰胺残基的出现大多是由单个碱基的替换造成的，有时也会发生两个碱基的替换，如GCA（丙氨酸）。

α-醇溶蛋白也是诱发乳糜泻病的主要活力蛋白[6]。目前关于α-醇溶蛋白中的毒性多肽报道的比较多，并且大多位于小麦的A和D基因组。据李玉阁等[12]报道B基因组来源的α-醇溶蛋白的毒性较小，而A、D基因组，尤其是D基因组来源的α-醇溶蛋白对CD患者具有较高的毒性。关于C基因组来源的α-醇溶蛋白的毒性报道较少，本研究克隆的5个α-醇溶蛋白没有发现毒性肽，因此对CD患者来说可能是安全的。

参 考 文 献：

[1] Dachkevich T， Redaelli R， Biancardi A M， et al. Genetics of gliadins code by the group 1 chromosome in high quality bread wheat cultivar Neepawa[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86： 389-399.

[2] 李敏， 高翔， 陈其皎， 等. 普通小麦中α-醇溶蛋白基因（GQ 891685） 的克隆、表达及品质效应鉴定[J]. 中国农业科学， 2010， 43（23）： 4765-4774.

[3] Woychik J H， Boundy J A， Dimler R J. Stareh gel-electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea[J]. Arch. Biochem. Biophys.， 1961， 94：477-482.

[4] 朱西平， 李鑫， 李雅轩， 等. 普通小麦及近缘粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆、定位与进化分析[J]. 作物学报， 2010， 36（4）： 580-589.

[5] 王曙光， 杨海峰， 孙黛珍， 等. 小麦醇溶蛋白亚基与品质性状的相关性分析[J]. 中国粮油学报， 2013， 28（5）：31-35.

[6] Li J， Wang S L， Cao M， et al. Cloning， expression， and evolutionary analysis of α-gliadin genes from Triticum and Aegilops genomes[J]. J. Appl. Genetics， 2013， 54： 157-167.

[7] Ciccippo R， Sabatino A D， Corazza G R.The immune recognition of gluten in coeliac disease[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2005， 140（3）：408-416.

[8] 杜旭烨， 周婷婷， 许骥坤， 等. 柱穗山羊草类燕麦储藏蛋白基因克隆和序列分析[J]. 山东农业科学， 2012， 44（11）： 1-4.

[9] Li M， Cao X， Chen Q J， et al. Cloning prokaryotic expression and in vitro function analysis of α-gliadin gene from common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（23）： 4765- 4774.

[10] Xie Z Z， Wang C Y， Wang K， et al. Molecular characterization of the celiac disease epitope domains in α-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheat （ Triticum aestivum L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121（7）： 1239-1251.

[11] Anderson O D， Greene F C. The α-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation， subfamily structure， and origins of pseudogenes [J]. Theor. Appl. Genet.， 1997， 95： 59-65.

[12] 李玉阁， 邢冉冉， 崔一飞， 等. 郑丰5号α-醇溶蛋白的克隆与序列分析[J]. 华北农学报， 2013， 28（4）： 46-52.

[13] 曹亚萍. 小麦的起源、进化与中国小麦遗传资源[J]. 小麦研究， 2008， 29（3）： 1-10.

2 结果与分析

3 讨论

较多研究表明醇溶蛋白的变异和分子结构与面粉的加工品质密切相关。本研究获得的5个α-醇溶蛋白虽然与已知的α-醇溶蛋白序列具有较高的同源性，但仍存在一些差异，如重复区长度的不同、多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺残基含量的不同以及非谷氨酰胺的出现等。多聚谷氨酰胺Ⅰ区和Ⅱ区是α-醇溶蛋白的典型特征，这两个区几乎全由谷氨酰胺组成。其中，编码谷氨酰胺的密码子有两个：CAG和CAA，它们以不同的串联重复形式出现，形成类似微卫星（SSR）的序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ区CAG和CAA两个密码子几乎各占一半，而在多聚谷氨酰胺Ⅱ区只出现CAA密码子。非谷氨酰胺的残基一般为A、E、L、R和K五种氨基酸中的一个或几个。Li等[9]研究表明长的重复区与面筋的加工品质呈正相关。另外，Xie等[10]研究表明高的谷氨酰胺残基含量会提高面筋的粘弹性，可能是由于谷氨酸盐间的相互作用提高了氢键的含量。Anderson等[11]指出，非谷氨酰胺残基的出现大多是由单个碱基的替换造成的，有时也会发生两个碱基的替换，如GCA（丙氨酸）。

α-醇溶蛋白也是诱发乳糜泻病的主要活力蛋白[6]。目前关于α-醇溶蛋白中的毒性多肽报道的比较多，并且大多位于小麦的A和D基因组。据李玉阁等[12]报道B基因组来源的α-醇溶蛋白的毒性较小，而A、D基因组，尤其是D基因组来源的α-醇溶蛋白对CD患者具有较高的毒性。关于C基因组来源的α-醇溶蛋白的毒性报道较少，本研究克隆的5个α-醇溶蛋白没有发现毒性肽，因此对CD患者来说可能是安全的。

参 考 文 献：

[1] Dachkevich T， Redaelli R， Biancardi A M， et al. Genetics of gliadins code by the group 1 chromosome in high quality bread wheat cultivar Neepawa[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86： 389-399.

[2] 李敏， 高翔， 陈其皎， 等. 普通小麦中α-醇溶蛋白基因（GQ 891685） 的克隆、表达及品质效应鉴定[J]. 中国农业科学， 2010， 43（23）： 4765-4774.

[3] Woychik J H， Boundy J A， Dimler R J. Stareh gel-electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea[J]. Arch. Biochem. Biophys.， 1961， 94：477-482.

[4] 朱西平， 李鑫， 李雅轩， 等. 普通小麦及近缘粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆、定位与进化分析[J]. 作物学报， 2010， 36（4）： 580-589.

[5] 王曙光， 杨海峰， 孙黛珍， 等. 小麦醇溶蛋白亚基与品质性状的相关性分析[J]. 中国粮油学报， 2013， 28（5）：31-35.

[6] Li J， Wang S L， Cao M， et al. Cloning， expression， and evolutionary analysis of α-gliadin genes from Triticum and Aegilops genomes[J]. J. Appl. Genetics， 2013， 54： 157-167.

[7] Ciccippo R， Sabatino A D， Corazza G R.The immune recognition of gluten in coeliac disease[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2005， 140（3）：408-416.

[8] 杜旭烨， 周婷婷， 许骥坤， 等. 柱穗山羊草类燕麦储藏蛋白基因克隆和序列分析[J]. 山东农业科学， 2012， 44（11）： 1-4.

[9] Li M， Cao X， Chen Q J， et al. Cloning prokaryotic expression and in vitro function analysis of α-gliadin gene from common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（23）： 4765- 4774.

[10] Xie Z Z， Wang C Y， Wang K， et al. Molecular characterization of the celiac disease epitope domains in α-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheat （ Triticum aestivum L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121（7）： 1239-1251.

[11] Anderson O D， Greene F C. The α-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation， subfamily structure， and origins of pseudogenes [J]. Theor. Appl. Genet.， 1997， 95： 59-65.

[12] 李玉阁， 邢冉冉， 崔一飞， 等. 郑丰5号α-醇溶蛋白的克隆与序列分析[J]. 华北农学报， 2013， 28（4）： 46-52.

[13] 曹亚萍. 小麦的起源、进化与中国小麦遗传资源[J]. 小麦研究， 2008， 29（3）： 1-10.

2 结果与分析

3 讨论

较多研究表明醇溶蛋白的变异和分子结构与面粉的加工品质密切相关。本研究获得的5个α-醇溶蛋白虽然与已知的α-醇溶蛋白序列具有较高的同源性，但仍存在一些差异，如重复区长度的不同、多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺残基含量的不同以及非谷氨酰胺的出现等。多聚谷氨酰胺Ⅰ区和Ⅱ区是α-醇溶蛋白的典型特征，这两个区几乎全由谷氨酰胺组成。其中，编码谷氨酰胺的密码子有两个：CAG和CAA，它们以不同的串联重复形式出现，形成类似微卫星（SSR）的序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ区CAG和CAA两个密码子几乎各占一半，而在多聚谷氨酰胺Ⅱ区只出现CAA密码子。非谷氨酰胺的残基一般为A、E、L、R和K五种氨基酸中的一个或几个。Li等[9]研究表明长的重复区与面筋的加工品质呈正相关。另外，Xie等[10]研究表明高的谷氨酰胺残基含量会提高面筋的粘弹性，可能是由于谷氨酸盐间的相互作用提高了氢键的含量。Anderson等[11]指出，非谷氨酰胺残基的出现大多是由单个碱基的替换造成的，有时也会发生两个碱基的替换，如GCA（丙氨酸）。

α-醇溶蛋白也是诱发乳糜泻病的主要活力蛋白[6]。目前关于α-醇溶蛋白中的毒性多肽报道的比较多，并且大多位于小麦的A和D基因组。据李玉阁等[12]报道B基因组来源的α-醇溶蛋白的毒性较小，而A、D基因组，尤其是D基因组来源的α-醇溶蛋白对CD患者具有较高的毒性。关于C基因组来源的α-醇溶蛋白的毒性报道较少，本研究克隆的5个α-醇溶蛋白没有发现毒性肽，因此对CD患者来说可能是安全的。

参 考 文 献：

[1] Dachkevich T， Redaelli R， Biancardi A M， et al. Genetics of gliadins code by the group 1 chromosome in high quality bread wheat cultivar Neepawa[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86： 389-399.

[2] 李敏， 高翔， 陈其皎， 等. 普通小麦中α-醇溶蛋白基因（GQ 891685） 的克隆、表达及品质效应鉴定[J]. 中国农业科学， 2010， 43（23）： 4765-4774.

[3] Woychik J H， Boundy J A， Dimler R J. Stareh gel-electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea[J]. Arch. Biochem. Biophys.， 1961， 94：477-482.

[4] 朱西平， 李鑫， 李雅轩， 等. 普通小麦及近缘粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆、定位与进化分析[J]. 作物学报， 2010， 36（4）： 580-589.

[5] 王曙光， 杨海峰， 孙黛珍， 等. 小麦醇溶蛋白亚基与品质性状的相关性分析[J]. 中国粮油学报， 2013， 28（5）：31-35.

[6] Li J， Wang S L， Cao M， et al. Cloning， expression， and evolutionary analysis of α-gliadin genes from Triticum and Aegilops genomes[J]. J. Appl. Genetics， 2013， 54： 157-167.

[7] Ciccippo R， Sabatino A D， Corazza G R.The immune recognition of gluten in coeliac disease[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2005， 140（3）：408-416.

[8] 杜旭烨， 周婷婷， 许骥坤， 等. 柱穗山羊草类燕麦储藏蛋白基因克隆和序列分析[J]. 山东农业科学， 2012， 44（11）： 1-4.

[9] Li M， Cao X， Chen Q J， et al. Cloning prokaryotic expression and in vitro function analysis of α-gliadin gene from common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（23）： 4765- 4774.

[10] Xie Z Z， Wang C Y， Wang K， et al. Molecular characterization of the celiac disease epitope domains in α-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheat （ Triticum aestivum L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121（7）： 1239-1251.

[11] Anderson O D， Greene F C. The α-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation， subfamily structure， and origins of pseudogenes [J]. Theor. Appl. Genet.， 1997， 95： 59-65.

[12] 李玉阁， 邢冉冉， 崔一飞， 等. 郑丰5号α-醇溶蛋白的克隆与序列分析[J]. 华北农学报， 2013， 28（4）： 46-52.

[13] 曹亚萍. 小麦的起源、进化与中国小麦遗传资源[J]. 小麦研究， 2008， 29（3）： 1-10.