手足口病患儿机体免疫功能临床研究

徐 俊，薛 建，黄 辉，邵雪军，朱 宏（苏州大学附属儿童医院检验科，江苏苏州 215003）

手足口病（HFMD）是以发热和手足、口腔等部位皮疹或疱疹性咽峡炎为主要特征的一种婴幼儿急性传染病，病原体包括柯萨奇病毒（Cox）A16型（CoxA16）、埃可病毒和肠道病毒71型（EV71）等，其中以CoxA16、EV71最常见。由于EV71引起的神经系统并发症，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹等较其他肠道病毒多见，且具有较高的病死率和致残率，因此日益受到重视［1］。目前，国内局部地区手足口病流行强度较大［2］。本研究对236例HFMD患儿免疫功能进行了分析，旨在探讨免疫功能变化在HFMD发生、发展过程中的作用，及其与疾病严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年7月至2012年5月本院收治的HFMD患儿236例，均符合《手足口病诊治指南（2010年版）》诊断标准［3］，且外周血EV71、CoxA16RNA检测均为阳性。236例患儿中，EV71RNA阳性且无并发症患儿99例（EV71组），男58例、女41例，平均年龄（2.00±1.06）岁；CoxA16 RNA阳性且无并发症患儿110例（CoxA16组），男71例、女39例，平均年龄（2.17±1.33）岁；经脑脊液或心肌钙蛋白检测确诊的合并脑膜脑炎或心肌炎患儿27例（重症组），包括EV71 RNA阳性患儿19例、CoxA16RNA阳性患儿8例，男15例、女12例，平均年龄（1.83±1.26）岁。同期收治的疝气患儿24例纳入对照组，男18例、女6例，平均年龄（2.22±1.17）岁。4组患儿性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 LC480型荧光定量聚合酶链反应（PCR）扩增仪（德国罗氏），Epics XL－MCL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter），EV71、CoxA16RNA荧光探针试剂盒（广州中山大学达安基因公司），荧光标记单克隆抗体（美国BD）。

1.3 方法

1.3.1 外周血EV71、CoxA16RNA检测 患儿入院后24h内采集外周血2mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用实时逆转录PCR技术检测EV71、CoxA16RNA，操作步骤参照试剂盒说明书。

1.3.2 淋巴细胞亚群检测 患儿入院后24h内采集外周血2 mL，肝素抗凝，取50μL混匀全血标本与相应的荧光标记单克隆抗体10μL充分混匀，室温条件下避光孵育15min后加入250μL溶血素，振荡混匀后37℃水浴15min，再加入250μL磷酸盐缓冲液（PBS），振荡混匀后37℃水浴15min，再加入1 mL PBS振荡混匀后1 800r／min离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁，加入250μL PBS，振荡混匀后采用流式细胞仪进行检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析；计量资料以表示，进行正态性检验及方差齐性检验后，采用单因素方差分析（one－way ANOVA）进行多组间比较，采用t检验进行两组间比较；P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

各研 究 组 间 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3－CD19＋、CD3－CD16＋CD56＋、CD19＋CD23＋和CD4＋CD25＋淋巴细胞亚群百分比比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。其中，EV71组、CoxA16组和重症组CD3＋和CD3＋CD4＋淋巴细胞亚群百分比均低于对照组（P＜0.05），重症组CD3＋淋巴细胞亚群百分比低于EV71组和CoxA16组（P＜0.05），但EV71组和CoxA16组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；重症组CD3＋CD8＋淋巴细胞亚群百分比低于对照组（P＜0.05），EV71组、CoxA16组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；EV71组、重症组CD3－CD19＋淋巴细胞亚群百分比高于对照组（P＜0.05），CoxA16组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；重症组CD3－CD16＋CD56＋淋巴细胞亚群百分比高于EV71组、CoxA16组和对照组（P＜0.05），但后3组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；EV71组、Cox－A16组和重症组CD19＋CD23＋淋巴细胞亚群百分比均较对照组升高（P＜0.05），且EV71组较CoxA16组和重症组升高更明显（P＜0.05）。EV71组、CoxA16组和重症组CD4＋CD25＋淋巴细胞亚群百分比均较对照组升高（P＜0.05）。

表1 各研究组患儿淋巴细胞亚群检测结果（%，）

表1 各研究组患儿淋巴细胞亚群检测结果（%，）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与重症组比较，＃P＜0.05；与CoxA16组比较，ΔP＜0.05；－：表示无数据。

组别 n CD3＋ CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD3－CD19＋ CD3－CD16＋CD56＋ CD19＋CD23＋ CD4＋CD25＋.18 13.50±5.98 5.00±2.11 4.77±0.79 EV71组 99 59.11±7.03＊＃ 30.22±6.53＊ 23.92±6.25＃ 26.25±7.27＊Δ 12.00±6.00＃ 14.16±5.61＊＃Δ 6.05±1.45＊CoxA16组 110 60.26±9.29＊＃ 32.82±6.29＊ 22.56±7.90＃ 22.83±6.31 13.00±6.10＃ 12.19±4.16＊ 6.05±1.60＊重症组 27 54.43±8.03＊ 29.69±7.03＊ 19.96±3.68＊ 25.68±6.5＊ 16.93±5.66＊ 11.19±4.23＊ 5.61±1.39＊F－ 9.581 5.571 3.803 7.875 5.480 25.443 5.846 P对照组 24 66.42±6.62 36.09±5.92 25.52±4.08 20.30±5－ 0.000 0.001 0.011 0.000 0.001 0.000 0.001

3 讨 论

HFMD是由肠道病毒感染导致的一类传染性疾病，常见于婴幼儿。肠道病毒属的Cox A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型，埃可病毒13型和EV71等均能引起HFMD，最常见的是CoxA16和 EV71［4－5］。本院2011年7月至2012年月收治的HFMD患儿以CoxAl6和EV71感染居多，大部分患儿临床表现为手、足斑丘疹或水疱疹及发热、咽痛，病程1周左右，预后良好；少数出现头痛、呕吐、意识障碍、脑膜刺激征等临床表现，极少数出现肢体弛缓性瘫痪、心动过速、气急、发绀、昏迷和呼吸衰竭，属于重症患儿［6－7］。

本研究发现，EV71或CoxA16感染后，无论普通型还是重症型HFMD患儿，免疫功能均发生明显改变。病毒感染机体后，参与防御的主要是T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞。在病毒入侵初期，作为机体固有免疫应答细胞的NK细胞首先产生应答，NK细胞活化后，产生干扰素γ（IFN－γ）、白细胞介素2（IL－2）、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子，诱导辅助性T淋巴细胞（Th淋巴细胞）分化表达，从而发挥免疫调节作用［8－9］。本研究中，重症HFMD患儿CD3－CD16＋CD56＋淋巴细胞亚群百分比较对照组、EV71组和CoxA16组明显增高，表明重症患儿机体内的NK细胞活化程度明显上调。

CD3分子主要表达在T淋巴细胞表面，是T细胞成熟的表面标志。CD3＋T淋巴细胞又分为CD3＋CD4＋T细胞和CD3＋CD8＋T细胞两类。CD3＋CD4＋T细胞主要为Th细胞，又可分为Th1和Th2型，前者参与机体对病毒和肿瘤的免疫反应，而后者参与对过敏性疾病和寄生虫的免疫反应。CD3＋CD8＋T细胞又称为细胞毒性T细胞，活化后可参与病毒的清除过程［10］。在 HFMD患儿中，CD3＋、CD3＋CD4＋T淋巴细胞亚群百分比较对照组明显下降，且重症患儿下降更显著，表明HFMD患儿在对抗肠道病毒感染时，CD3＋、CD3＋CD4＋T细胞明显受到抑制，且重症患儿更为严重。重症组患儿CD3＋CD8＋T淋巴细胞亚群百分比明显下降，CoxA16组和EV71组均无明显变化，提示重症患儿对肠道病毒的清除能力明显下降，CD3＋CD8＋T淋巴细胞亚群百分比的降低程度可能与疾病严重程度及预后有关。

CD4＋CD25＋T细胞则是一类调节性T细胞，能发挥抑制免疫调节的作用［11］。本研究中，HFMD患儿CD4＋CD25＋T淋巴细胞亚群百分比均上升，提示肠道病毒感染后，机体在CD4＋CD25＋T细胞的作用下，免疫调节作用受到了抑制。

本研究中，HFMD患儿体内具有体液免疫功能的B淋巴细胞CD3－CD19＋亚群及调节分化、黏附的CD19＋CD23＋淋巴细胞亚群百分比较对照组升高。这可能是细胞免疫功能抑制后，体液免疫功能的相对增高，也可能是机体在感染肠道病毒后，增强了相应的体液免疫能力。此外，EV71组升高较Cox－A16组更明显，可能是由于EV71感染后抑制细胞免疫功能的能力更强或增强体液免疫功能的能力更强。

综上所述，EV71和CoxA16感染所致HFMD患儿体内存在免疫功能的紊乱，重症患儿免疫功能紊乱更为明显，尤以CD3＋、CD3＋CD8＋和CD3－CD16＋CD56＋亚群的异常更为突出。在临床诊治过程中，应尽早对HFMD患儿进行CD3＋、CD3＋CD8＋和CD3－CD16＋CD56＋亚群监测，了解其动态变化，从而对患儿病情严重程度及预后作为正确判断，同时应根据患儿免疫功能的具体状态，给予适当的调节免疫功能的治疗，从而提高治疗效果。

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