五峰马里兰烟草花叶病及病毒检测

2014-10-20 18:50张曙光孙红绪王彦芬
湖北农业科学 2014年16期
关键词:病毒检测

张曙光 孙红绪 王彦芬

摘要:为了摸清五峰马里兰烟草花叶病毒病的发生情况,采用田间调查和实验室RT-PCR技术进行了TMV、CMV和PVY的感染情况检测。结果表明,在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染,复合感染率为50%。其中,以TMV感染为主,检出率为100%;其次是CMV感染,检出率为50%;然后是PVY感染,检出率为40%。

关键词:五峰马里兰烟区;烟草花叶病;病毒检测; RT-PCR

中图分类号:S435.72 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)16-3809-03

Abstract:In order to find out the occurrence of tobacco mosaic diseases in Maryland tabacco areas of Wufeng county,the infection of TMV,CMV and PVY was detected with RT-PCR technology and field investigation. The results showed that mixed infection with three viruses usually had complex symptom and the mixed infection rate was about 50%. The virus with the highest detection rate(100%)was TMV,followed by CMV and PVY with the detection rate of 50% and 40%,respectively.

Key words: Wufeng Maryland tobacco areas;tabacco mosaic disease;virus detection.

烟草花叶病毒病俗称烟草花叶病,是目前烟草产区分布最广、发生最为普遍的一类病害。1989~1991年进行的全国烟草侵染性病害调查表明,引起烟草病毒病的病毒共有17种[1]。据李锡宏等[2]调查,在湖北烟区发生的花叶病毒病主要是烟草普通花叶病(TMV)、黄瓜花叶病(CMV)和马铃薯Y病毒病(PVY),马里兰烟以CMV和PVY感染为主。近几年来,五峰马里兰烟草花叶病毒病连年发生,且呈逐年加重趋势,已成为危害烟草的一种主要病害,严重影响了五峰烟叶生产。为了进一步摸清五峰马里兰烟草花叶病毒病的发生情况,更有效地开展防治,进行了烟草花叶病毒病调查与病毒检测。

1 材料与方法

1.1 田间调查与取样

在湖北省五峰县王家坪村马里兰烟叶示范基地田间进行调查与取样,于5~8月采取系统调查与随机调查相结合,调查烟草花叶病毒病发病率,观察记载不同症状的发生情况。

在发病烟株上选取10份分别表现为脉明、斑驳、花叶、黄化、皱缩、卷曲等典型症状的新鲜烟草叶片,用保鲜膜包裹带回实验室检测。

1.2 引物

4种引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,详情见表1。

1.3 RNA提取

采样柱式分离方法提取RNA,步骤为:取待检材料嫩叶0.1 g,加液氮研磨成粉状,快速转入1.5 mL离心管中,加入800 μL SDS提取缓冲液,剧烈摇晃至混匀,65 ℃水浴5 min后离心,加入800 μL Binding Buffer混匀并加入400 μL无水乙醇,将混匀后的溶液加入吸附柱中。分别加入700 μL Wash Buffer和700 μL 80%乙醇洗涤(2次),风干后,溶于50 μL无菌水,-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR扩增

以提取的总RNA为模板,合成cDNA第一链,反应体系为20 μL,含5×反转录缓冲液4 μL、dNTPs (5 μmol/μL)1 μL、RNA酶抑制剂(RNasin,40 U/μL) 0.5 μL、M-MLV (200 U/μL) 0.5 μL、随机引物(100 pmol/μL)1 μL、RNA模板3 μL和DEPC处理水10 μL。PCR反应总体系为25 μL,含10×PCR溶液2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 0.5 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)[宝生物工程(大连)有限公司]0.2 μL、正向和反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)、总核酸1 μL和灭菌的去离子水。扩增条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳后在EB中染色10 min,将其置于凝胶成像系统上观察并记录结果。

1.5 扩增产物克隆及测序

RT-PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下切取含目标产物的凝胶,按琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(V3.0,北京道普生物科技有限公司)说明回收目标DNA,与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株感受态细胞,涂布在含50 mg/L氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)的LB固体培养基上,于37 ℃培养过夜。待菌落长出后随机挑取一定数量的白色单菌落,在含50 mg/L Amp的LB液体培养基中振荡培养,PCR鉴定为阳性克隆后,将菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 田间烟草花叶病毒病调查结果

根据2012-2013年在五峰马里兰烟区的田间系统调查,烟草花叶病毒病一般始发于5月中下旬至6月上旬,7月上中旬达到发病高峰期。一般发病率为30%~40%,重病田发病率可达70%~80%。症状表现为脉明、退绿、斑驳、花叶、黄化、皱缩、卷曲等多样化典型病毒症状,说明田间症状具有复杂性,并存在大量复合感染。在感染病毒的植株中下部成熟烟草叶片上症状不明显,出现隐症现象,仅在顶端嫩叶上呈现典型病毒病症状。

2.2 烟草花叶病毒病类型检测

利用RT-PCR技术对10份新鲜烟叶病害标本进行TMV、CMV和PVY的感染情况检测(表2)。各选取一个病毒分离物的扩增产物进行克隆和测序,序列分析结果显示,各病毒扩增片段与GenBank登录的相应病毒的核苷酸序列相似性达97%以上,确认检测结果正确。

2.2.1 黄瓜花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2对CMV进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到5份为阳性(图1),检出率为50%。

2.2.2 烟草花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物TMV mpf/3nr对TMV进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到10份为阳性(图2),检出率为100%。

2.2.3 马铃薯Y病毒RT-PCR检测结果 采用引物PVY P5/P3对PVY进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到4份为阳性(图3),检出率为40%。

3 讨论

根据检测结果,在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染,复合感染率为50%。既有TMV+CMV感染,也有TMV+PVY感染,还可以是TMV+CMV+PVY复合感染。与张友臣等[7]对十堰市烟草病毒病的调查“单独侵染占41.89%,复合侵染占58.11%”的结论基本一致。从五峰马里兰烟区引起花叶病的病毒来看,主要以TMV侵染为主,检出率为100%;其次是CMV侵染,检出率为50%;然后是PVY侵染,检出率为40%。与李锡宏等[2]认为湖北马里兰烟区烟草花叶病以CMV、PVY感染为主的结论不同。

由于TMV抗逆性强,能在土壤和粪肥中长时间存活,存在于土壤或肥料中的带毒烟叶残体往往是其主要初侵染源,田间主要通过接触摩擦传染,整枝打顶、中耕除草等农事操作造成的微伤也能引起反复再侵染,使病害扩大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是来自感病的黄瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物,在田间通过蚜虫传播,引起病害蔓延。目前在五峰烟区推广栽培的五峰1号是由马里兰烟609(Md609)选育而来,对TMV、CMV和PVY不具抗性,表现感病[8]。因此,培育无毒烟苗和有效防治蚜虫成为病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制剂GHA-Virizol、抗性激活剂R12,可以钝化病毒活性、抑制病毒在植物体内增殖,具有一定的防治效果[9]。

参考文献:

[1] 李怀方,刘凤权,郭小密,等.园艺植物病理学[M].北京:中国农业大学出版社,2001.

[2] 李锡宏,黎妍妍,许汝冰.湖北省烟草主要病害发生规律及原因浅析[J].湖北植保,2010(5):15-16.

[3] 徐平东,周仲驹,林奇英,等.黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较[J].病毒学报,1999(2):164-170.

[4] 刘文洪,洪 健,陈集双,等.侵染东方百合的黄瓜花叶病毒两个分离物CP基因克隆和进化分析[J].农业生物技术学报,2004(4):442-445.

[5] 黄金光,邓丛良,李怀方,等.烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定[J].植物病理学报,2004,34(3):215-220.

[6] 吴兴泉,陈士华,陈 涛,等.河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定[J].河南农业科学,2007(10):64-66.

[7] 张友臣,李锡宏,雎 韡,等.十堰市烟草病毒病的调查及防治策略[J].湖北农业科学,2013,52(2):327-330.

[8] 钱祖坤,文光红,赵传良,等.马里兰烟新品种五峰1号的选育及特征特性[J].安徽农业科学,2012,40(24):11972-11973.

[9] 周建国,肖启明,刘双清,等,烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学,2013,41(1):121-122.

(责任编辑 陈 焰)

2.2 烟草花叶病毒病类型检测

利用RT-PCR技术对10份新鲜烟叶病害标本进行TMV、CMV和PVY的感染情况检测(表2)。各选取一个病毒分离物的扩增产物进行克隆和测序,序列分析结果显示,各病毒扩增片段与GenBank登录的相应病毒的核苷酸序列相似性达97%以上,确认检测结果正确。

2.2.1 黄瓜花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2对CMV进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到5份为阳性(图1),检出率为50%。

2.2.2 烟草花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物TMV mpf/3nr对TMV进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到10份为阳性(图2),检出率为100%。

2.2.3 马铃薯Y病毒RT-PCR检测结果 采用引物PVY P5/P3对PVY进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到4份为阳性(图3),检出率为40%。

3 讨论

根据检测结果,在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染,复合感染率为50%。既有TMV+CMV感染,也有TMV+PVY感染,还可以是TMV+CMV+PVY复合感染。与张友臣等[7]对十堰市烟草病毒病的调查“单独侵染占41.89%,复合侵染占58.11%”的结论基本一致。从五峰马里兰烟区引起花叶病的病毒来看,主要以TMV侵染为主,检出率为100%;其次是CMV侵染,检出率为50%;然后是PVY侵染,检出率为40%。与李锡宏等[2]认为湖北马里兰烟区烟草花叶病以CMV、PVY感染为主的结论不同。

由于TMV抗逆性强,能在土壤和粪肥中长时间存活,存在于土壤或肥料中的带毒烟叶残体往往是其主要初侵染源,田间主要通过接触摩擦传染,整枝打顶、中耕除草等农事操作造成的微伤也能引起反复再侵染,使病害扩大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是来自感病的黄瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物,在田间通过蚜虫传播,引起病害蔓延。目前在五峰烟区推广栽培的五峰1号是由马里兰烟609(Md609)选育而来,对TMV、CMV和PVY不具抗性,表现感病[8]。因此,培育无毒烟苗和有效防治蚜虫成为病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制剂GHA-Virizol、抗性激活剂R12,可以钝化病毒活性、抑制病毒在植物体内增殖,具有一定的防治效果[9]。

参考文献:

[1] 李怀方,刘凤权,郭小密,等.园艺植物病理学[M].北京:中国农业大学出版社,2001.

[2] 李锡宏,黎妍妍,许汝冰.湖北省烟草主要病害发生规律及原因浅析[J].湖北植保,2010(5):15-16.

[3] 徐平东,周仲驹,林奇英,等.黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较[J].病毒学报,1999(2):164-170.

[4] 刘文洪,洪 健,陈集双,等.侵染东方百合的黄瓜花叶病毒两个分离物CP基因克隆和进化分析[J].农业生物技术学报,2004(4):442-445.

[5] 黄金光,邓丛良,李怀方,等.烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定[J].植物病理学报,2004,34(3):215-220.

[6] 吴兴泉,陈士华,陈 涛,等.河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定[J].河南农业科学,2007(10):64-66.

[7] 张友臣,李锡宏,雎 韡,等.十堰市烟草病毒病的调查及防治策略[J].湖北农业科学,2013,52(2):327-330.

[8] 钱祖坤,文光红,赵传良,等.马里兰烟新品种五峰1号的选育及特征特性[J].安徽农业科学,2012,40(24):11972-11973.

[9] 周建国,肖启明,刘双清,等,烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学,2013,41(1):121-122.

(责任编辑 陈 焰)

2.2 烟草花叶病毒病类型检测

利用RT-PCR技术对10份新鲜烟叶病害标本进行TMV、CMV和PVY的感染情况检测(表2)。各选取一个病毒分离物的扩增产物进行克隆和测序,序列分析结果显示,各病毒扩增片段与GenBank登录的相应病毒的核苷酸序列相似性达97%以上,确认检测结果正确。

2.2.1 黄瓜花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2对CMV进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到5份为阳性(图1),检出率为50%。

2.2.2 烟草花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物TMV mpf/3nr对TMV进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到10份为阳性(图2),检出率为100%。

2.2.3 马铃薯Y病毒RT-PCR检测结果 采用引物PVY P5/P3对PVY进行RT-PCR扩增检测,从10份烟草样品中检测到4份为阳性(图3),检出率为40%。

3 讨论

根据检测结果,在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染,复合感染率为50%。既有TMV+CMV感染,也有TMV+PVY感染,还可以是TMV+CMV+PVY复合感染。与张友臣等[7]对十堰市烟草病毒病的调查“单独侵染占41.89%,复合侵染占58.11%”的结论基本一致。从五峰马里兰烟区引起花叶病的病毒来看,主要以TMV侵染为主,检出率为100%;其次是CMV侵染,检出率为50%;然后是PVY侵染,检出率为40%。与李锡宏等[2]认为湖北马里兰烟区烟草花叶病以CMV、PVY感染为主的结论不同。

由于TMV抗逆性强,能在土壤和粪肥中长时间存活,存在于土壤或肥料中的带毒烟叶残体往往是其主要初侵染源,田间主要通过接触摩擦传染,整枝打顶、中耕除草等农事操作造成的微伤也能引起反复再侵染,使病害扩大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是来自感病的黄瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物,在田间通过蚜虫传播,引起病害蔓延。目前在五峰烟区推广栽培的五峰1号是由马里兰烟609(Md609)选育而来,对TMV、CMV和PVY不具抗性,表现感病[8]。因此,培育无毒烟苗和有效防治蚜虫成为病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制剂GHA-Virizol、抗性激活剂R12,可以钝化病毒活性、抑制病毒在植物体内增殖,具有一定的防治效果[9]。

参考文献:

[1] 李怀方,刘凤权,郭小密,等.园艺植物病理学[M].北京:中国农业大学出版社,2001.

[2] 李锡宏,黎妍妍,许汝冰.湖北省烟草主要病害发生规律及原因浅析[J].湖北植保,2010(5):15-16.

[3] 徐平东,周仲驹,林奇英,等.黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较[J].病毒学报,1999(2):164-170.

[4] 刘文洪,洪 健,陈集双,等.侵染东方百合的黄瓜花叶病毒两个分离物CP基因克隆和进化分析[J].农业生物技术学报,2004(4):442-445.

[5] 黄金光,邓丛良,李怀方,等.烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定[J].植物病理学报,2004,34(3):215-220.

[6] 吴兴泉,陈士华,陈 涛,等.河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定[J].河南农业科学,2007(10):64-66.

[7] 张友臣,李锡宏,雎 韡,等.十堰市烟草病毒病的调查及防治策略[J].湖北农业科学,2013,52(2):327-330.

[8] 钱祖坤,文光红,赵传良,等.马里兰烟新品种五峰1号的选育及特征特性[J].安徽农业科学,2012,40(24):11972-11973.

[9] 周建国,肖启明,刘双清,等,烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学,2013,41(1):121-122.

(责任编辑 陈 焰)

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