核质互作型雄性不育水稻分蘖期超氧化物歧化酶和丙二醛含量变化

李建欣+代西梅+李林玉+黄群策

摘要：为进一步了解水稻雄性不育现象，研究了核质互作型雄性不育水稻不育系451A及保持系451B分蘖期叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）含量的动态变化情况。结果表明，不育系水稻营养生长阶段的分蘖期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表现异常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，导致不育系水稻MDA含量较高，这可能引起了水稻能量、物质代谢异常，膜脂过氧化逐渐积累，从而造成了花粉败育。

关键词：水稻；雄性不育系；分蘖期；超氧化物歧化酶；丙二醛

中图分类号：S511.03 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0081-02

雄性不育是雄性器官退化、发育不良或花粉败育，不能行使生殖能力而雌蕊发育正常的现象。雄性不育起源于遗传性远缘异质的植物杂交，后代产生了生理、代谢紊乱，致使雄性生殖细胞败育。植物雄性不育有2种类型：一种为生理上的雄性不育，是由逆境胁迫及各种理化因素造成的，不育性不能传给后代，育种上不能连续利用；另一种为遗传上的雄性不育，是受雄性不育基因控制，这种基因一般属隐性，有重要的利用价值^[1]。核质互作型雄性不育又称细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），属于遗传不育。植物育性的表达是由基因控制的生理过程、生化反应、形态构建的最终结果，包括一系列物质代谢、能量代谢，涉及各种复杂的生理生化反应。基因控制酶蛋白的合成，酶又调控代谢反应，多个代谢反应的综合集中表现便是性状。因此育性的变化也是酶活性变化引起的结果之一^[2]。植物在代谢过程中产生有氧自由基，遇逆境胁迫时，植物体内大量增生自由基，致使膜脂过氧化严重，造成膜结构受损，蛋白质结构被改变，最终对生物体产生伤害。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是植物抗氧化酶促防御系统中的3个主要酶类。SOD对活性氧的清除反应过程为：2O-2+2H+→H2O2+O2，POD、CAT进一步催化H2O2分解成H2O从而彻底解毒，使植物体内活性氧保持在较低水平，这3种酶协同作用，可减轻自由基对生物体造成的毒害，提高机体抗逆能力。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，它的含量高低可反映细胞膜受损害的程度。前人对水稻生殖生长阶段的生理生化反应进行了研究，但是关于水稻营养生长阶段的动态研究还比较少。本研究以核质互作型雄性不育水稻为材料，调查了分蘖期水稻叶片中SOD、POD、CAT、MDA含量变化，以探讨水稻不育系不育的生理机制，旨在为进一步丰富水稻雄性不育理论提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

核质互作型雄性不育水稻451A及保持系451B均由河南省新乡市农业科学院秋粮研究所提供。供试水稻种植于河南省新乡市农业科学院内，采用常规管理。水稻分蘖初期到后期每隔5 d取1次材料。取每株主茎上面第1张全展叶，每次取3张叶中部，放冰上带回实验室统一进行酶活测定。

1.2 粗酶液提取和酶活性测定

称取叶片样品0.5 g置于预冷的研钵中，加入1 mL预冷的磷酸缓冲液（pH值为7.8），冰浴研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 mL，于11 000×g、4 ℃下离心15 min，上清液即为SOD、POD、CAT粗提液，3次重复^[3-4]。采用NBT（氮蓝四唑）光还原法测定叶片SOD活性。反应液为3 mL NBT、1 mL酶液，对照液为3 mL NBT、1 mL磷酸缓冲液（pH值为7.8），25～30 ℃、4 000 lx于日光下反应20 min，调零液遮光，560 nm 下测定吸光度值。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位来表示。采用愈创木酚法测定POD活性。反应液为2.7 mL磷酸缓冲液、100 μL愈创木酚、100 μL H2O2、100 μL酶液，470 nm下测定吸光度值，每隔 1 min 读数1次，共测4 min，磷酸缓冲液调零。采用紫外吸收法测定CAT活性。反应液为2.8 mL磷酸缓冲液（pH值为7.8）、100 μL H2O2、100 μL酶液，240 nm下测定吸光度值，每隔1 min读数1次，共测4 min，磷酸缓冲液调零。MDA提取与活性测定：称取叶片样品1 g置于预冷的研钵中，加入2 mL 10% TCA、少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 mL TCA进一步研磨匀浆，4 000 r/min离心10 min，上清液为样品提取液。采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。吸取离心的上清液 2 mL，加入2 mL 0.6% TBA溶液，混匀于沸水浴上反应 15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、450 nm波长下的吸光度值，蒸馏水调零。

2 结果与分析

2.1 MDA含量的变化

由表1可见，分蘖期前期不育系水稻叶片中MDA含量极显著高于保持系，分蘖期后期不育系仍然显著高于保持系，但是没有分蘖前期显著。总体来说，不育系由分蘖前期到分蘖后期有下降的趋势，保持系变化没有不育系大。

2.2 SOD活性的变化

由表1可见，分蘖期前3个时间点不育系及保持系水稻叶片SOD活性均下降，分蘖期后3个时间点不育系及保持系水稻叶片SOD活性均上升。每个时期不育系水稻叶片SOD活性均高于保持系。

2.3 CAT活性的变化

由表1可见，从分蘖期开始到最后，不育系水稻叶片CAT活性有波动但是整体变化不大，保持系水稻叶片CAT活性下降趋势明显，总体而言，不育系水稻分蘖期不育系叶片CAT活性略低于保持系。

2.4 POD活性的变化

由表1可见，分蘖期前2个时间点不育系及保持系水稻叶片POD活性均下降，分蘖期后4个时间点不育系及保持系后3个时间点水稻叶片POD活性均上升。从总体趋势来看，不育系水稻叶片POD活性高于保持系。

3 结论与讨论

酶是生物体内的一种特殊的催化刑，由活的生物体合成。酶的活性取决于其蛋白质结构的完整性，任何破坏酶蛋白的因素都能导致酶活性丧失。酶有调控代谢反应的功能，正是由于酶、代谢、生理功能之间的相互关系，使得酶活性变化与育性变化有着密切的关系。植物体内酶的种类、存在量的多少、酶的方向都会直接影响植株生长发育、可育与不育等特性。

植物生长过程中，不断吸收H2O及CO2进行光合作用，生产有机物质并放出O2，氧在自身还原过程中形成阴离子自由基、羟自由基的活性氧。在光合作用中，植物不可避免地要经受强光、高温环境，光激发产生的多余能量在光合器中形成单线态氧[5～8]。在光呼吸等代谢过程中，也会有许多H2O2产生，这些H2O2可以通过Habcr-Weiss反应产生毒性更强的OH·自由基。OH·可引发脂质尤其是膜不饱和脂的过氧化，损害生物膜结构，改变蛋白质结构，损伤DNA等生物大分子的结构与功能等。在生物进化过程中，生物也形成了抵抗活性氧伤害的防御系统。SOD是植物体内解除O-2毒害作用的关键性酶。CAT、POD则将H2O2通过Habcr-Weiss反应进一步分解而彻底解毒。

以往学者们对于不育水稻抗氧化酶促防御系统几种关键指标的研究结果不尽相同。陈贤丰等以PTGMS不育系农垦58S和w6154S为材料研究发现，单核早期、单核晚期、二核及三核期的不育花药2种酶在每小穗花药中的总活性普遍低于其可育花药^[9]。张明永等比较了CMS水稻不育系珍汕97A及其同核异质保持系珍汕97B，结果表明，与可育三核期花药相比，不育三核期2种酶活性较低^[10]。梅启明等研究发现，从穗发育雌雄蕊原基分化期到三核期，不育系农垦58S幼穗或花药中SOD活性明显比其可育状态下的高^[11]。邹国林等研究发现，穗分化第2次枝梗原基分化期至花粉母细胞形成期，农垦58S叶片SOD比活力高于农垦58，同一品种，长日SOD活性高于短日，农垦58S 叶片CAT比活力变化较显著，但无规律^[12]。

本研究表明，分蘖期不育系水稻SOD活性比保持系高，推测不育系受到了更强的H2O2伤害，在此时期不育系水稻CAT活性反而远远小于保持系，由此可推测不育系有更多的OH·自由基没有被清除，导致MDA含量增大。分蘖期不育系水稻SOD活性始终高于保持系也从侧面证明了不育系受到比保持系更多的H2O2伤害。不育系水稻CAT的酶活性比保持系少，由此可推测在此过程中不育系受OH·自由基的损害作用大，证明不育系一直有较多的脂质尤其是膜不饱和脂过氧化。前人发现，细胞质雄性不育水稻的花粉败育大多数发生在减数分裂期到二核期，分蘖期要远远早于花粉败育时期。根据MDA、SOD、POD、CAT一系列变化结果说明了水稻核质互作型雄性不育花粉败育是一个逐渐积累的、由量变到质变的过程，而不是一个“跃迁”的过程，推测可能从分蘖期甚至更早的发育时期花药的酶促系统已出现了异常，最后发育至花粉败育时期。本试验中，不育系水稻营养生长阶段的分蘖期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表现异常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，导致不育系水稻MDA含量较高，这可能引起了水稻能量、物质代谢异常，膜脂过氧化逐渐积累，从而造成了花粉败育。

参考文献：

[1]朱英国，利容千，汪明全. 水稻雄性不育生物学[M]. 武汉：武汉大学出版社，2000.

[2]梅启明，朱英国，张红军. 湖北光敏核不育水稻中酶的反应特征研究[J]. 华中农业大学学报，1990，9（4）：469-471.

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