泪腺肿瘤组织中GPX3基因mRNA和蛋白的表达及其相关性

赵凯

泪腺肿瘤是眼眶较为常见的肿瘤之一。泪腺肿瘤的发生发展与多种基因功能的改变密切相关，是一个复杂的多步骤的过程，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活［1-3］。谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPX3)是GPXs家族中的成员之一，是近年来发现的具有抑癌作用的基因［4］。在人类的许多恶性肿瘤中低表达，而在泪腺肿瘤组织中，GPX3基因mRNA和蛋白的表达及其相关性的有关报道尚少［5-8］。本研究分别从mRNA及蛋白水平检测GPX3基因在32例泪腺多形性腺瘤、28例泪腺腺样囊性癌及9例正常泪腺组织中的表达，并探讨其表达和泪腺肿瘤发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究随机选取2011年1月至2014年2月郑州大学附属郑州中心医院眼科手术标本。根据患者的病理组织学检查结果，将所取标本进行分组。泪腺良性肿瘤组患者的标本32例，为泪腺多形性腺瘤;泪腺恶性肿瘤组患者的标本28例，为泪腺腺样囊性癌;开放性眼眶损伤患者所切除的损伤部位泪腺共9例，为正常泪腺组织组。其中男33例，女36例，年龄21～77岁，中位年龄 49岁。所有病例术前均未接受化学治疗、放射治疗。所取标本即刻用液氮冻存并在－80℃条件下保存。

1.2 主要试剂 RNA试剂及RT-PCR反应试剂盒购自大连TakaRa生物技术公司。抗GPX3兔抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。鼠抗人内参β-actin一抗购自北京康为世纪公司。

1.3 RT-PCR检测 GPX3的 mRNA表达 取50 mg组织应用 Trizol法提取组织中的 RNA，经 Nanodrop分光光度计检测其纯度和浓度。取 2 μg总RNA，按照试剂盒说明逆转合成 cDNA。然后进行PCR 扩增，反应体系:cDNA 1 μL，PCR 混合物 9.5 μL，上下游引物各 1 μL，双蒸水补至 25 μL。GPX3引物序列:上游 5’-TAGGGAGCCCTCACCATTGAT-3’，下游 5’-CTGAGTTCACTCCTGGTTCCT-3。β-actin引物序列:上游 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游5’-TAAAGACCTCTATGCCAGT-3’。循环参数:94℃ 4 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72 ℃1 min，35个循环，72 ℃ 终延伸 7 min。取PCR 产物5 μL，20 g·L－1琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。用去离子水作阴性对照。使用Quantity-one软件，计算各个样本GPX3表达水平，表达量的相对值=待测基因扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的灰度值。

1.4 Western blot检测 GPX3的蛋白表达 取30 μg组织总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳80 V，待蛋白至分离胶后120 V。湿转220 mA，2 h后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。50 g·L－1脱脂奶粉封闭1 h。加入1∶1000的1×TBS稀释的一抗GPX3，4℃过夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶3000的1×TBS稀释的二抗，室温1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶1000的1×TBS稀释的鼠抗人内参β-actin一抗，4℃过夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶3000的1×TBS稀释的二抗，室温1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。待暗室加入ECL发光剂曝光，显影。使用Quantity-one软件计算各个样本GPX3蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。统计计数资料，组间比较采用Fisher’s精确检验法;GPX3在不同性别、年龄、肿瘤大小泪腺上皮性肿瘤中的表达差异采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常泪腺组织与良、恶性泪腺肿瘤组织中GPX3 mRNA的表达 泪腺组织正常组、泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌中的GPX3 mRNA表达量分别为 0.90±0.01、0.48±0.03 和 0.21±0.01(表1)，正常泪腺组织和泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌的GPX3 mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05);泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌中GPX3 mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05);GPX3 mRNA表达量在正常泪腺组织中明显高于泪腺多形性腺瘤(P＜0.05，见图1);正常泪腺组织与泪腺腺样囊性癌相比，其GPX3 mRNA的表达差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表1 正常泪腺组织、泪腺多形性腺瘤和泪腺腺样囊性癌中GPX3 mRNA转录结果Table 1 Expression of GPX3 mRNA in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland

Figure 1 Expression level of GPX3 mRNA in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland by RT-PCR.Ne:Negative control;N:Normal neoplasms of lacrimal gland;T:Benign neoplasms of lacrimal gland;C:Malignant neoplasms of lacrimal gland RT-PCR分析GPX3 mRNA在正常泪腺组织、泪腺多形性腺瘤和泪腺腺样囊性癌中的表达。Ne:阴性对照;N:正常泪腺组织;T:泪腺多形性腺瘤;C:泪腺腺样囊性癌

2.2 正常泪腺组织与良、恶性泪腺肿瘤组织中GPX3蛋白的表达 正常泪腺组织、泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌中的GPX3蛋白表达量分别为1985.00±121.63、768.01±121.32、0(表2)。正常泪腺组织和泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌的GPX3蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05);泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌中GPX3蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05);GPX3蛋白表达量在正常泪腺组织中明显高于泪腺多形性腺瘤(P＜0.05，见图2);正常泪腺组织与泪腺腺样囊性癌相比，GPX3蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 泪腺正常组织、泪腺多形性腺瘤和泪腺腺样囊性癌中GPX3蛋白表达结果Table 2 Expression of GPX3 protein in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland

2.3 GPX3 mRNA和蛋白的表达与其临床病理特征的关系 如表3所示:GPX3 mRNA在泪腺腺样囊性癌中的表达与患者的年龄、性别及肿瘤大小无关，其mRNA的表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。如表4所示:GPX3蛋白的表达与其临床病理特征分析显示，与患者的年龄、性别、肿瘤大小差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。

Figure 2 Expression level of GPX3 protein in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland by RT-PCR.N:Normal neoplasms of lacrimal gland;T:Benign neoplasms of lacrimal gland;C:Malignant neoplasms of lacrimal gland Western blot印记分析GPX3蛋白在正常泪腺组织、泪腺多形性腺瘤和泪腺腺样囊性癌中的表达。N:正常泪腺组织;T:泪腺多形性腺瘤;C:泪腺腺样囊性癌

表3 GPX3 mRNA与泪腺腺样囊性癌临床病理特征的关系Table 3 Relationship between GPX3 mRNA expression and clinical features in malignant neoplasms of lacrimal gland

表4 GPX3蛋白与泪腺腺样囊性癌临床病理特征的关系Table 4 Relationship between GPX3 protein expression and clinical features in malignant neoplasms of lacrimal gland

3 讨论

肿瘤的发生、发展及恶变是多因素、多阶段、多步骤和多基因改变的过程［9-10］。泪腺上皮性肿瘤是眼眶内常见肿瘤之一，它包括一类组织成分多样性、肿瘤异质性明显的泪腺肿物［11］。其中良性肿瘤易复发和恶变，恶性肿瘤复发及死亡率较高。因此，从分子生物学水平揭示泪腺良恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移机制，研究其生物学指标具有重要的意义。癌细胞能够产生大量的活性氧簇并起到抑制凋亡的作用，并且过氧化氢有辅助增殖、侵袭、迁移及促进血管形成的作用。细胞的命运有赖于体内活性氧簇的平衡。与正常细胞相比，癌细胞具有两大特点，活性氧簇的产量增加和活性氧的清除能力下降。很多相关的酶，如超氧化物歧化酶、GPX和一些抗氧化物的过氧化氢酶以及能够中和活性氧簇的酶类作用下降［12-13］。

GPX3是GPX家族中的成员之一，主要由肾脏的近端小管合成，是一种具有典型前导序列的胞外酶。该基因位于5q23，是一个在肿瘤中常见的染色体杂合性缺失位点［4］。GPX3是一种氧自由基代谢酶，它在正常组织中是高表达的，被认为具有抑癌基因的活性。GPX3在胃癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中表达显著下降［4-5，7-8］。

本实验运用RT-PCR及Western blot检测32例泪腺多形性腺瘤、28例泪腺腺样囊性癌及9例正常泪腺组织中GPX3的mRNA及蛋白的表达情况，结果显示，良、恶性泪腺肿瘤组织GPX3 mRNA在基因转录水平上均低于泪腺正常组织(均为P＜0.05)，提示泪腺组织中GPX3的转录水平的降低和失活与肿瘤的发生有关。进而我们通过蛋白水平研究发现，泪腺恶性肿瘤组织中GPX3蛋白的表达低于泪腺良性肿瘤组织(P＜0.05)，说明GPX3基因的低表达或者缺失可能是正常泪腺组织及泪腺良性肿瘤组织恶变的机制之一，其转录水平下调和蛋白表达降低与泪腺组织恶性转化有一定的关系。并且GPX3的表达与年龄、性别和肿瘤大小无关。

GPX3蛋白表达降低参与了恶性泪腺组织的发生和发展，检测GPX3蛋白的表达有助于泪腺肿瘤的筛查、早期临床诊断和判断预后。

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