牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析

王志强++俞红贤等

摘要：通过RT-PCR技术克隆牦牛SLC25A6基因的cDNA序列，并利用DNAMAN、MAGA 6、SWISS-MODEL、ExPASy 等生物信息学软件系统对其进行分析。结果表明，扩增出的牦牛SLC25A6基因的编码区长897 bp，编码298个氨基酸；与普通牛、绵羊和人的相应基因核苷酸序列进行比对，序列一致性分别为99.33%、98.22%、91.86%；其编码蛋白分子量为32.821 ku，含多个修饰位点。

关键词：牦牛；线粒体；SLC25A6基因；ANT3蛋白；生物信息学

中图分类号： Q753文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0036-04

收稿日期：2014-03-19

基金项目：国家自然科学基金（编号：31260588）；青海省自然科学基金（编号：2011-Z-901）。

作者简介：王志强（1988—），男，河南焦作人，硕士研究生，主要从事高原家畜形态学结构特点与高原环境的关系研究。E-mail：wzqqhu@163.com。

通信作者：荆海霞，博士，副教授，主要从事高原家畜形态学结构特点与高原环境的关系研究。E-mail：jinghaixia1@163.com。线粒体作为机体能量供应站，通过对组织氧的利用为细胞的能量代谢提供不可或缺的能量货币——三磷酸腺苷（ATP）。因此，长期生活在氧气相对缺乏的高原环境中的牦牛对氧气及能量的充分利用显得尤为重要。而在能量代谢过程中，溶质载体家族25（solute carrier family 25，SLC25）发挥着重要作用。SLC25是一类能够将大量分子通过线粒体膜进行转运的蛋白[1]。除SLC25A17外，其余SLC25s均位于线粒体内膜，因此被认为是线粒体载体[2]。线粒体载体家族中的腺嘌呤核苷酸转运蛋白3（ADP/ATP translocase 3）别称ANT3，由SLC25A6基因编码，是线粒体内膜上重要的载体蛋白，能够促进ATP与二磷酸腺苷（ADP）之间的交换。ANT在为细胞的生命活动提供能量的同时，也为线粒体基质内氧化磷酸化反应提供底物，促使胞质耗能与线粒体产能这一反应链有序进行[3]。有研究显示，ANT3是白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）反向调节的新靶点，与细胞凋亡有密切关系；IL-4或IFN-γ单独作用于T细胞时能够上调ANT3及其基因水平的表达，当IL-4与IFN-γ共同作用时能够下调ANT3的表达水平。相反，ANT的其他亚型不受IL-4或 IFN-γ 影响；另外，地塞米松诱导细胞凋亡时产生的IL-4和IFN-γ细胞因子通过调节ANT3表达水平而影响调节性T细胞的存活率[4-5]。ANT3的瞬间过量表达会导致培养细胞的凋亡，但该凋亡现象能够被米酵酸菌或环孢菌素A所抑制[6]。目前，对高原牦牛腺苷酸转运体的研究几近空白，因此本试验通过对牦牛腺苷酸转运体基因及其表达蛋白进行研究，以期揭示高原牦牛线粒体的低氧适应机制，并为高原医学提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1动物来源及样品处理

于海拔4 k m左右的青海省大通种牛场选取健康成年牦牛，颈动脉放血致死，迅速取脑组织皮层样本，将其置于液氮中低温保存，用于提取总RNA。

1.2方法

1.2.1设计并合成引物通过美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）查询普通牛SLC25A6基因的mRNA序列（NM_174660.2），并根据其序列利用DNAMAN、Primer 5设计特异性引物；共设计2对引物，分别用于扩增牦牛目的基因的5′端及3′端，记为引物1、引物2，预计其扩增目的片段长度分别为401、651 bp；引物设计后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息见表1。

1.2.2总RNA的提取利用RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取牦牛总RNA。使用BIO-RAD核酸蛋白检测仪测定RNA浓度及纯度，同时利用紫外透视仪对RNA凝胶电泳结果进行检测。

1.2.3RT-PCR反应及SLC25A6基因扩增利用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，该反应体系为20 μL。以反转录产物为模板进行PCR扩增反应，反应加样体系如下：模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O2 105 μL，solarbio 2×Taq PCR MasterMix（含染料）12.5 μL。引物1的PCR扩增程序为：95 ℃ 预变性3 min；95 ℃变性 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃ 5 min。引物2的PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性 30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃ 5 min，产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4克隆SLC25A6基因并验证利用solarbio琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物纯化，与pMD19-T vector在16 ℃下连接1 h；然后经42 ℃热击及冰浴等反应与大肠杆菌 DH5α感受态细胞进行连接，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素（Amp）、5-溴-4氯-3吲哚基-β-D-半乳糖（X-gal）和异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的LB固体培养基平板上，37 ℃恒温箱中培养12 h；挑取白色阳性单菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，振荡培养12 h。利用通用引物对菌液进行PCR鉴定，再对阳性转化子进行测序。

1.3数据处理分析

牦牛SLC25A6基因的CDS区测序结果，用DNAMAN、MAGA 6、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息学软件进行DNA序列拼接、结构分析、编码蛋白的氨基酸序列预测、蛋白的性质分析和三维结构构建。比较牦牛SLC25A6核苷酸序列及氨基酸序列与普通牛、绵羊、人的一致性。

2结果与分析

2.1提取的总RNA检测结果

利用BIO-RAD核酸蛋白检测仪测得RNA的纯度D260 nm/D280 nm值及浓度分别为1.985、1.056 μg/μL。凝胶电泳检测结果如图1所示。

2.2SLC25A6基因扩增结果及克隆后验证结果

SLC25A6基因扩增片段及克隆后片段长度均与预计长度相符（图2），经转化后的阳性转化子测序鉴定正确。

2.3牦牛SLC25A6基因的核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列

拼接SLC25A6基因5′端及3′端测序结果显示，拼接后序列全长968 bp，其中CDS序列长897 bp，CDS序列中碱基组分为腺嘌呤18.6%、鸟嘌呤32.2%、胸腺嘧啶17.2%、胞嘧啶32%。SLC25A6基因共编码298个氨基酸（图3），其中精氨

酸、甲硫氨酸、脯氨酸分别占总氨基酸残基的6.04%、268%、2.35%。

2.4牦牛SLC25A6基因及其编码蛋白的氨基酸序列与其他物种的一致性

将牦牛的SLC25A6基因及其编码蛋白的氨基酸序列与普通牛（Bos taurus）、绵羊（Ovis aries）和人（homo sapiens）等物种的相应序列进行比对，结果与牛、绵羊和人在核苷酸序列上的一致性分别为99.33%、98.22%、91.86%，在相应的氨基酸序列上的一致性分别为100.00%、99.66%、97.65% （表2），说明SLC25A6基因及其编码蛋白氨基酸序列在牦牛、普通牛、绵羊和人之间具有较高的一致性，该基因的编码蛋白在进化过程中相对较保守。

表2牦牛与普通牛、绵羊、人基因序列及氨基酸序列一致性比较

物种基因序列一致性（%）氨基酸序列一致性（%）牦牛普通牛羊牦牛普通牛羊普通牛99.33100.00绵羊98.2297.7799.6699.66人91.8691.5392.0897.6597.6597.99

利用MAGA 6构建系统进化树，采用的算法、模型、可信度评估方法分别为NJ算法、Tajima-Nei模型、自举法，自举法重复取样1 000次（图4）。

2.5牦牛SLC25A6蛋白的二、三级结构

牦牛SLC25A6基因CDS序列编码肽链分子量约为32821 ku，DNAMAN预测其等电点为10.35，为碱性蛋白。

功能域位点包括1个酪氨酸激酶磷酸化位点（244～251）；1个酰胺化位点（242～245）；1个N-糖基化位点（178～181）；4个蛋白激酶C磷酸化位点（150～152、197～199、233～235、242～244）；3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（148～151、150～153、165～168）；13个N-酰基化位点（15～20、16～21、53～58、73～78、115～120、120～125、121～126、156～161、172～177、193～198、253～258、273～278、281～286）。

腺苷酸转运体标志性多肽（RRRMMM模体）氨基酸残基位置为235～240。腺苷酸转运体特征性保守序列PX（D/E）XX（K/R）氨基酸残基序列分别为PIERVK、PLDFAR、PFDTVR，3条保守序列氨基酸残基位置分别为28～33、133～138、230～235。

通过NPS@IBCP服务器的SOPMA预测ANT3的二级结构，结果如图5所示。其中，α-螺旋占50.67%、β-转角占805%、无规卷曲占25.84%、延伸链占15.44%。

利用腺苷酸转运体（PDB：1okc.1.A，分辨率 2.20 ）作为ANT3结构建模的参考蛋白，通过同源建模服务器SWISS MODEL建立牦牛ANT3蛋白的三级结构（图6）[7-8]。

3结论与讨论

腺苷酸转运体的主要作用是实现线粒体内外ATP与ADP的交换。腺苷酸转运体的核苷酸结合位点只能识别不与Mg2+形成复合体的腺嘌呤核苷酸，不能与其余的核苷酸相结合；腺苷酸转运体这一功能的实现与其蛋白结构密切相关[1]。

腺苷酸转运体具有3个重复的同源序列，每个序列约由100个氨基酸残基组成，其中有24个相同或同源替换的氨基酸残基[9]。3个重复的同源序列各形成2个α-螺旋，α-螺旋相对于膜及彼此之间都是倾斜的。6个α-螺旋形成1个紧凑的跨膜结构域，结构域表面朝向线粒体膜间隙，形成1个锥形凹陷。锥形凹陷最大直径为20 ，深30 ；在结构域的底部有1段腺苷酸转运体的标志性多肽——RRRMMM，多肽中精氨酸与腺苷酸的结合有关，而甲硫氨酸则与控制转运进程有关，RRRMMM模体中精氨酸的突变会破坏腺苷酸转运体的活性；底物结合到结构域底部时，腺苷酸转运体构象瞬间从“凹”变为“通道”状，致使底物移位[1]。

腺苷酸转运体也有一个标志性的模体，含有P-X-[D/E]-X-X-[R/K]特征性序列，在线粒体溶质载体家族的所有成员及其3个重复序列中相对保守[10]。其中，脯氨酸在转运过程中充当铰链作用，通过拉直部分α-螺旋链，使腺苷酸转运体结构发生改变，打开蛋白通道，为ADP/ATP的成功运输提供条件[1]。

本研究通过克隆并分析SLC25A6基因序列，研究其表达的氨基酸序列及其蛋白二、三级结构，结果表明，SLC25A6基因CDS序列长897 bp，与普通牛、绵羊和人在核苷酸序列上的一致性分别为99.33%、98.22%、91.86%；普通牛与牦牛CDS序列相比，突变点发生在第72、102、123、378、477、660位点，基因序列相对保守。SLC25A6基因共编码298个氨基酸，其中对腺苷酸转运体活性起关键作用的精氨酸占氨基酸残基总量的6.04%，与绵羊和人在氨基酸序列上的一致性分别为99.66%、97.65%；由于碱基突变点均发生在密码子第3位核苷酸上，而第3位核苷酸的改变并不会影响所编码的氨基酸，比对后发现牦牛与普通牛氨基酸序列一致性为100%，表明该基因的编码蛋白在进化过程中相对较保守。该蛋白包含1个酪氨酸激酶磷酸化位点、1个酰胺化位点、1个N-糖基化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、13个N-酰基化位点；在ANT3中，标志性多肽（RRRMMM模体）氨基酸残基位置为235～240，特征性保守序列PX（D/E）XX（K/R）氨基酸残基序列分别为PIERVK、PLDFAR、PFDTVR。

本研究结果为以后进行实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等相关试验提供了理论依据，有利于深入探讨高原低氧环境对牦牛腺苷酸转运体结构及功能的影响。

参考文献：

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：40-42.

本研究结果为以后进行实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等相关试验提供了理论依据，有利于深入探讨高原低氧环境对牦牛腺苷酸转运体结构及功能的影响。

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